人參皂苷Rg3誘導(dǎo)乳腺癌MCF7Adr細(xì)胞凋亡的作用及其可能的分子機(jī)制

張　立

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥品試劑供應(yīng)科，武漢 430060)

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人參皂苷Rg3誘導(dǎo)乳腺癌MCF7Adr細(xì)胞凋亡的作用及其可能的分子機(jī)制

張立

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥品試劑供應(yīng)科，武漢 430060)

摘要：目的研究人參皂苷Rg3誘導(dǎo)乳腺癌MCF7Adr細(xì)胞凋亡的作用及其可能的分子機(jī)制。方法培養(yǎng)乳腺癌MCF7Adr細(xì)胞，分為不含胎牛血清和藥物培養(yǎng)基處理的對照組以及100、200、400、800 μmol/L人參皂苷Rg3處理的處理組。采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞增殖情況，Western-blot方法檢測細(xì)胞周期蛋白E(Cyclin E)、細(xì)胞分裂周期蛋白25A(CDC25A)水平。結(jié)果100 μmol/L人參皂苷組、200 μmol/L人參皂苷組、400 μmol/L人參皂苷組、800 μmol/L人參皂苷組的MTT值、Cyclin E、CDC25A蛋白水平均低于對照組[(76.4±16.4)、(56.3±11.5)、(35.2±6.9)、(20.4±4.2)比(100.0±19.5)；(84.3±16.1)、(60.5±12.1)、(39.1±5.2)、(24.5±3.9)比(100.0±18.5)；(79.5±14.8)、(59.1±10.9)、(35.4±6.1)、(22.7±4.2)比(100.0±18.5)]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。；MTT值與Cyclin E、CDC25A蛋白水平呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論人參皂苷Rg3能劑量依賴性地誘導(dǎo)乳腺癌MCF7Adr細(xì)胞凋亡，且這一作用是通過抑制Cyclin E、CDC25A的表達(dá)來發(fā)揮的。

關(guān)鍵詞：乳腺癌；人參皂苷Rg3；凋亡；細(xì)胞周期蛋白E

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，在臨床治療時多采用手術(shù)切除、化療、生物治療等綜合療法。常規(guī)的化療藥物具有較強(qiáng)的不良反應(yīng)，且容易產(chǎn)生抗藥性，整體的化療效果并不理想。近年來，臨床學(xué)者致力于探究具有抗腫瘤作用的天然化合物，從人參根中提取的人參皂苷單體是具有抗腫瘤作用的純天然化合物。本研究主要分析人參皂苷Rg3誘導(dǎo)乳腺癌MCF7Adr細(xì)胞凋亡的作用，并對其可能的分子機(jī)制進(jìn)行探究。

1材料與方法

1.1材料乳腺癌細(xì)胞系MCF7Adr購買于中國科學(xué)院細(xì)胞庫；杜爾伯科極限必需培養(yǎng)基(Dulbecco minimum essential medium，DMEM)培養(yǎng)基和胎牛血清均購買于美國Sigma公司；抗體購買于英國Abcam公司；離心管和細(xì)胞培養(yǎng)板購買于美國Corning 公司；人參皂苷Rg3由醫(yī)院藥劑科提供。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)方法凍存在液氮罐中的細(xì)胞取出后復(fù)蘇，在15 cm2的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細(xì)胞處于對數(shù)生長期且鋪滿培養(yǎng)瓶底面70%～80%時進(jìn)行傳代，分別接種于培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板中。培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞用于繼續(xù)傳代，培養(yǎng)板中的細(xì)胞用于加藥處理。

1.2.2細(xì)胞處理方法當(dāng)培養(yǎng)板中的細(xì)胞鋪滿50%～60%時，用不含胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h，使其生長同步化，隨后分別用不含F(xiàn)BS和藥物培養(yǎng)基處理(對照組)，100、200、400、800 μmol/L 人參皂苷Rg3處理(處理組)。24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行噻唑藍(lán)(MTT)檢測和Western-blot檢測。

1.2.3MTT法藥物處理24 h后，小心吸去上清，加入160 μL DMEM培養(yǎng)基、40 μL 0.5% MTT溶液，孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。隨后吸盡上清，每孔加入200 μL二甲基亞砜，置于搖床上低速振蕩10 min，而后在酶標(biāo)測儀上檢測490 nm處的吸光值，以對照組的吸光值為100，計算觀察組吸光值的相對值。

1.2.4Western-blot檢測配置RIPA蛋白裂解液，每個細(xì)胞孔中加入60 μL，用細(xì)胞刮刀充分刮碎細(xì)胞并吸出裂解液，離心后去上清進(jìn)行檢測。檢測時，首先按照配方配置4%的濃縮膠和10%的分離膠，將蛋白樣品加入點樣孔中并進(jìn)行電泳，垂直電泳方法為100 V、20 min，120 V、90 min，完成后進(jìn)行電轉(zhuǎn)膜，方法為100 V、90 min。轉(zhuǎn)膜后取出硝酸纖維素膜，在5%脫脂牛奶中封閉2 h，而后在1∶1000的細(xì)胞周期蛋白E(Cyclin E)、細(xì)胞分裂周期蛋白25A(cell division cycle 25A，CDC25A)、actin第一抗體中孵育過夜。第2日，將硝酸纖維素膜置于TBST溶液中洗滌3遍，而后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行孵育，1 h后再次用TBST洗滌3遍，最后進(jìn)行顯影。計算蛋白條帶的灰度值，以目的基因的灰度值/內(nèi)參actin灰度值作為蛋白含量，令空白對照組的蛋白含量作為100，計算處理組目的基因的蛋白含量。

2結(jié)果

2.1各組MTT檢測結(jié)果及Cyclin E、CDC25A表達(dá)量比較對照組、100 μmol/L人參皂苷組、200 μmol/L人參皂苷組、400 μmol/L人參皂苷組、800 μmol/L人參皂苷組各組間MTT值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)； 100 μmol/L人參皂苷組、200 μmol/L人參皂苷組、400 μmol/L人參皂苷組、800 μmol/L 人參皂苷組的MTT值均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.886，t=9.966，t=16.623，t=26.223，均P<0.01)。對照組、100 μmol/L人參皂苷組、200 μmol/L人參皂苷組、400 μmol/L人參皂苷組、800 μmol/L人參皂苷組各組間Cyclin E、CDC25A蛋白水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，100 μmol/L人參皂苷組、200 μmol/L人參皂苷組、400 μmol/L人參皂苷組、800 μmol/L人參皂苷組的Cyclin E、CDC25A蛋白水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.985，t=7.113，t=16.623，t=22.334，均P<0.01；t=5.342，t=8.823，t=17.103，t=24.423，均P<0.01)，見表1。不同濃度人參皂苷Rg3處理后細(xì)胞Cyclin E、CDC25A表達(dá)量的電泳結(jié)果見圖1。

表1各組MTT檢測結(jié)果及Cyclin E、CDC25A

表達(dá)量比較

組 別MTT值CyclinE蛋白CDC25A蛋白對照組100.0±19.5100.0±18.5100.0±18.5100μmol/L人參皂苷組76.4±16.4a84.3±16.1a79.5±14.8a200μmol/L人參皂苷組56.3±11.5a60.5±12.1a59.1±10.9a400μmol/L人參皂苷組35.2±6.9a39.1±5.2a35.4±6.1a800μmol/L人參皂苷組20.4±4.2a24.5±3.9a22.7±4.2aF17.79215.34517.7293P<0.05<0.05<0.05

MTT：噻唑藍(lán)；Cyclin E：細(xì)胞周期蛋白E；CDC25A：細(xì)胞分裂周期蛋白25A；a與對照組比較，P<0.01

圖1　不同濃度人參皂苷Rg3處理后細(xì)胞周期蛋白E(Cyclin E)、細(xì)胞分裂周期蛋白25A(CDC25A)表達(dá)量的檢測結(jié)果　a與對照組比較，P<0.05

2.2細(xì)胞增殖能力與Cyclin E、CDC25A蛋白含量的線性回歸分析以MTT值為自變量，Cyclin E、CDC25A蛋白含量為應(yīng)變量進(jìn)行線性回歸分析可知，MTT值與Cyclin E、CDC25A蛋白含量呈正相關(guān)(P<0.05),見表2。

表2　細(xì)胞增殖能力與Cyclin E、CDC25A

Cyclin E:細(xì)胞周期蛋白E；CDC25A：細(xì)胞分裂周期蛋白25A

3討論

近年來，人參皂苷單體的抗腫瘤作用受到了越來越多的關(guān)注，Zhang等[1]的在體研究結(jié)果顯示，腹腔注射人參皂苷可以抑制小鼠體內(nèi)卵巢癌的生長、減小瘤體體積。人參皂苷的活性單體形式包括人參皂苷Rg3、Rh2等，活性單體均能作用于不同的靶點來發(fā)揮抗腫瘤作用[2]。人參皂苷Rg3是一種從人參根的浸出液中分離出的四環(huán)三萜皂苷[3]。陳云等[2]在乳腺癌MCF-7細(xì)胞系中的研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg3能使G0/G1期、S期細(xì)胞的數(shù)目顯著減少，而G2/M期細(xì)胞的數(shù)目顯著增多，細(xì)胞增殖停滯；同時，人參皂苷Rg3還能有效抑制MCF-7細(xì)胞株的增殖和侵襲能力。本研究通過MTT方法檢測乳腺癌MCF7Adr細(xì)胞株的細(xì)胞活力可知，人參皂苷Rg3處理組的MTT值低于對照組，且效應(yīng)具有劑量依賴性。這一結(jié)果也與Ge 等[4]在體內(nèi)實驗和離體實驗的結(jié)果一致，可以反映出人參皂苷Rg3在抑制乳腺癌細(xì)胞增殖中的確切價值。

無限的增殖能力以及向周圍組織極強(qiáng)的遷移、侵襲能力是惡性腫瘤細(xì)胞最具特征性的生物學(xué)行為，這也是導(dǎo)致化療藥物耐受、腫瘤局部復(fù)發(fā)以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的決定性因素[5]。惡性腫瘤細(xì)胞的增殖過程受多種機(jī)制的調(diào)控，其中CDC25A、Cyclin E是兩種在細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮重要作用的蛋白[6]。CDC25A是雙重特異性磷酸酶家族的成員之一，作用靶點為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶，通過催化細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶發(fā)生去磷酸化并促進(jìn)細(xì)胞增殖由G1期進(jìn)入S期[7]。目前，在結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤的研究中均發(fā)現(xiàn)CDC25A呈高表達(dá)狀態(tài)，且與患者的預(yù)后情況密切相關(guān)[8-9]。Cyclin E是一類細(xì)胞周期蛋白，在細(xì)胞增殖的G1～S期表達(dá)，通過與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin dependent kinase 2，CDK2)結(jié)合并形成Cyclin E-CDK2復(fù)合物，CDK2激活后可調(diào)節(jié)細(xì)胞由G1期向S期過渡。在惡性腫瘤細(xì)胞中，Cyclin E過度表達(dá)可使CDK2持續(xù)激活，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的不斷增殖[10]。Gao等[11]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞中存在Cyclin E和CDK2的異常表達(dá)，表現(xiàn)為Cyclin E的表達(dá)與細(xì)胞周期不同步。

目前，雖然人參皂苷Rg3的抗腫瘤作用已受到廣泛認(rèn)可，但關(guān)于該藥物具體的分子機(jī)制尚未完全闡明，藥物潛在的分子作用靶點仍處于未知狀態(tài)。探尋在乳腺癌癌細(xì)胞無限增殖過程中的關(guān)鍵分子，有助于為尋找更為有效的生物治療靶點。如前所述，CDC25A、Cyclin E是兩種與細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期密切相關(guān)的蛋白[12]，通過Western blot的方法檢測乳腺癌細(xì)胞中相關(guān)蛋白的含量可知，人參皂苷Rg3處理組的CDC25A、Cyclin E蛋白含量均低于對照組，且效應(yīng)具有劑量依賴性。這就初步反映了人參皂苷Rg3對CDC25A、Cyclin E的調(diào)控作用，也可能是人參皂苷Rg3抑制細(xì)胞增殖的潛在分子機(jī)制。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)行線性回歸分析結(jié)果顯示，MTT值與Cyclin E、CDC25A蛋白含量呈正相關(guān)，提示下調(diào)CDC25A、Cyclin E可能是人參皂苷抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。

綜上所述，人參皂苷Rg3能劑量依賴性地誘導(dǎo)乳腺癌MCF7Adr細(xì)胞凋亡，且這一作用是通過抑制Cyclin E、CDC25A的表達(dá)來發(fā)揮的。

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Effect of Ginsenoside Rg3 on the Induction of MCF7Adr Cells Apoptosis of Breast Cancer and Its Possible Molecular MechanismsZHANGLi.(DepartmentofReagentsandSupply,People′sHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China)

Abstract:ObjectiveTo study the effect of Ginsenoside Rg3 on the induction of MCF7Adr cells apoptosis of breast cancer and its possible molecular mechanisms.MethodsMCF7Adr breast cancer cells were cultured and divided into control group treated with DMEM without FBS and drug,treatment group treated with 100,200,400, 800 μmol/L of ginsenoside Rg3.Cell proliferation was detected by MTT method, protein levels of Cyclin E,cell division cycle (CDC)25A were detected by Western-blot method.ResultsMTT value and protein level of Cyclin E,CDC25A of 100 μmol/L ginsenoside group，200 μmol/L ginsenoside group，400 μmol/L ginsenoside group，800 μmol/L ginsenoside group were lower than those in control group[(76.4±16.4),(56.3±11.5),(35.2±6.9),(20.4±4.2) vs (100.0±19.5)；(84.3±16.1),(60.5±12.1),(39.1±5.2),(24.5±3.9) vs (100.0±18.5)；(79.5±14.8),(59.1±10.9),(35.4±6.1),(22.7±4.2)vs(100.0±18.5)](P<0.01);MTT value was positively correlated content of protein Cyclin E,CDC25A(P<0.05).ConclusionGinsenoside Rg3 can dose dependently induce MCF7Adr cells apoptosis of breast cancer and which is functioned through inhibiting the expression of Cyclin E,CDC25A.

Key words:Breat cancer; Ginsenoside Rg3; Apoptosis; Cyclin E

收稿日期：2014-09-29修回日期：2015-02-27編輯：伊姍

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.18.047

中圖分類號：R737.9

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)18-3391-03