p16基因甲基化在胃癌發病機制中的作用

崔　勇, 張　剛, 李　中, 林曉萌, 張軍華

(河北大學附屬醫院 腫瘤外科, 河北 保定, 071000)

p16基因甲基化在胃癌發病機制中的作用

崔勇, 張剛, 李中, 林曉萌, 張軍華

(河北大學附屬醫院 腫瘤外科, 河北 保定, 071000)

摘要:目的通過檢測胃癌組織p16基因的啟動子CpG島甲基化狀態，探討其在胃癌發病機制中的作用，及其與胃癌臨床病理特征之間的關系。方法選取經胃鏡檢查診斷為胃癌的74例患者(胃癌組)及36例胃黏膜組織正常者(對照組)，應用甲基化特異性PCR(MSP)檢測正常胃黏膜組織和胃癌組織p16基因的啟動子CpG島的甲基化狀態，并分析p16基因甲基化與胃癌臨床病理特征之間的關系。結果胃癌組p16基因的甲基化陽性率為56.8%, 對照組未發現p16基因甲基化，差異具有統計學意義(P<0.05); p16基因甲基化表達與胃癌患者的淋巴結轉移、遠處轉移及病變的浸潤深度有關(P<0.05), 但與性別、年齡、腫瘤大小、部位和組織學類型無關。結論在胃癌發生發展中，p16基因甲基化修飾起著非常重要的作用，可作為反映胃癌侵襲轉移的生物學指標。

關鍵詞:p16基因; 甲基化; 胃癌; 生物學指標

胃癌是臨床較為常見的消化道惡性腫瘤，多種抑癌基因的失活以及癌基因的活化是導致其發生的重要原因[1]。p16基因作為腫瘤抑制基因，其表達異常將導致腫瘤的發生發展[2-3]。遺傳學研究表明，抑癌基因啟動子區域CpG島的異常甲基化與胃癌的形成密切相關[4]。因此，本研究檢測p16基因啟動子在胃癌組織中的甲基化狀況，并對比正常胃黏膜組織p16基因甲基化表達，旨在探討胃癌發病機制中p16基因甲基化的作用以及其與胃癌臨床病理特征之間的關系。

1資料與方法

1.1　一般資料

選擇2013年1月—2014年10月河北大學附屬醫院收治的74例胃癌患者設為胃癌組，所有患者均經胃鏡檢查，并經手術及病理確診為胃癌。其中男45例，女29例；年齡35～85歲，平均(57.4±5.2)歲。腫瘤分化程度：高分化17例，中分化22例，低分化35例；腫瘤發生部位：賁門胃底11例，胃體26例，胃竇37例；TNM分期：I期19例，Ⅱ期13例，Ⅲ期20例，Ⅳ期22例；腫瘤直徑：直徑<5 cm 53例，≥5 cm 21例。另選擇本院同期行胃鏡檢查且胃黏膜正常的人群作為對照組，共36例。其中男16例，女20例；年齡29～75歲，平均(55.5±4.2)歲。2組患者年齡、性別等一般資料比較無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。2組患者均取典型病變組織，置于-80 ℃冰箱內保存待用。

1.2　方法

1.2.1亞硫酸氫鹽修飾及DNA提取：按照美國Epigentek公司產品說明書進行亞硫酸氫鹽修飾操作。基因組DNA的提取按照大連TaKaRa公司試劑盒說明書進行；提取產物的DNA濃度和純度由美國Bio-Rad公司Smart Spec plus核酸測定儀檢測，若OD260/OD280在1.6～1.8, 置于-20 ℃的冰箱備用。

1.2.2聚合酶鏈反應(PCR): 應用甲基化和非甲基化特異性引物將已進行修飾的DNA進行PCR, 并參考其他學者的研究進行p16基因引物設計[5]。PCR反應體系：Taq酶0.5 μL, 模板DNA 2.5 ng, 上游引物1 μL, 下游引物1 μL, Buffer 25 μL, dNTP 8 μL，滅菌蒸餾水加至50 μL。p16-M引物序列(甲基化特異性引物): 5′-TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC-3′, 5′-GA CCCCGAACCGCGACCGTAA-3′, 退火溫度為62 ℃, 產物長度150 bp。p16-U引物序列(非甲基化特異性引物): 5′-TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT-3′, 5′-CAACCCCAAACCACAACCATAA-3′, 退火溫度為62 ℃, 產物長度151 bp。PCR產物行4%瓊脂糖電泳，經Gel DocTM XR凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)進行分析。

1.3　統計學分析

應用SPSS 13.0統計分析軟件進行Fisher精確檢驗或χ2檢驗。相關性分析采用Spearman檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1　p16基因甲基化

在胃癌組患者中, p16基因甲基化陽性為42例，檢出率56.8%, 對照組未發現p16基因甲基化，兩組比較差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

1.胃癌組;2.對照組圖1 2組p16基因甲基化分析

2.2　p16基因甲基化與胃癌臨床病理特征之間的關系

如表1所示，p16基因甲基化與胃癌患者性別、年齡、腫瘤部位、大小和組織學類型無明顯相關性(P>0.05)，而與淋巴結轉移、遠處轉移和病變的浸潤密切相關(P<0.05)。

表1　p16基因甲基化與胃癌臨床病理特征的關系

3討論

胃癌為消化道最常見惡性腫瘤，亞洲韓國、日本和中國是胃癌高發區，中國年發病率和死亡率是世界平均水平的2倍[6]。遺傳學研究結果表明，抑癌基因啟動子區域CpG島的異常甲基化修飾在腫瘤的形成中發揮重要作用[7-8]。甲基化修飾通過多種機制參與轉錄調控，如下所示: ① 下同干擾識別序列與特異性結合蛋白的結合; ② 間接抑制基因的表達，主要通過組蛋白甲基化轉移酶/組蛋白去乙酰化酶結合甲基化位點上的結合蛋白，形成核小體來實現。

p16基因位于染色體9p21區，主要在CDK6- PRb-E2F/cyclinDl-CDK4環路中發揮負反饋調節作用。p16基因變異將導致cyclinDl-CDK4/CDK6- PRb-E2F環路無限制進行下去，進而導致細胞過度增殖、癌癥發生[9]。有學者的研究表明，肺癌、結腸癌、肝癌等癌癥患者的癌組織標本、腫瘤細胞株中，頻繁出現p16基因甲基化現象[10-12], 這種甲基化現象可能是p16表達無表達或下調的主要原因之一。在本研究中，正常胃黏膜組織均未見p16基因甲基化片段(陽性)，但胃癌組織中p16基因甲基化的檢出率為56.8%, 這與國內學者的研究結果相一致[13-14]。為進一步p16基因甲基化與胃癌的相關性，有學者應用5-氟尿嘧啶輔助化療，對胃癌患者術后進行治療，結果發現，5-氟尿嘧啶能有效降低p16基因甲基化陽性胃癌患者的復發率，其原因可能是胃癌組織p16基因甲基化，導致p16蛋白表達減少；而處于S期的癌細胞數量的增加，增加了5-氟尿嘧啶的吸收水平，從而促進了5-氟尿嘧啶抑制胃癌細胞的作用[15]。可見，檢測胃癌患者癌組織中p16基因甲基化，不僅能診斷胃癌，還可以為胃癌患者術后治療和預后評估提供重要理論依據。

本研究對p16基因甲基化和胃癌患者臨床病理特征之間的關系進行了進一步的分析，結果表明，p16基因甲基化與胃癌患者年齡、性別、腫瘤部位、大小及組織學類型無關，而與胃癌淋巴結轉移及病變的浸潤深度密切相關。胃癌淋巴結轉移、遠處轉移及病變的浸潤深度是反映胃癌病變、預后的重要標準，直接反映了癌細胞侵襲、轉移的能力。本研究中，胃癌組織中p16基因甲基化與胃癌分析密切相關，提示p16基因甲基化與胃癌侵襲、轉移能力有關。可見，p16基因甲基化是進一步探索腫瘤轉移機制的重要靶點。

綜上所述，對p16基因啟動子進行甲基化檢測，并結合病理學檢測結果，能提高胃癌檢出率。在胃癌發生發展中，p16基因甲基化修飾起著非常重要的作用，可作為反映胃癌侵襲轉移的生物學指標。

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Role of p16 gene methylation in the

pathogenesis of gastric cancer

CUI Yong, ZHANG Gang, LI Zhong, LIN Xiaomeng, ZHANG Junhua

(SurgicalOncology,AffiliatedHospitalofHebeiUniversity,Baoding,Hebei, 071000)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the effect of p16 gene methylation in the pathogenesis of gastric cancer by detecting the methylation state of promoter CpG island of p16 gene in gastric cancer tissue, and its relationship with the clinicopathological features. MethodsThe methylation state of promoter CpG island of p16 gene in tissues of 74 patients with gastric cancer (gastric cancer group) and 36 normal people (control group) confirmed by stomachoscopy was detected by methylation specific PCR (MSP) for analyzing the relationship between the p16 gene methylation and clinicopathological features. ResultsThe positive methylation rate of p16 gene in gastric cancer group was 56.8%, with significant difference compared with control group (P<0.05), for p16 gene methylation was not found in control group. Moreover, the expression of p16 gene methylation was related to lymphatic metastasis, distant metastasis, depth of infiltration of lesion (P<0.05), but not associated with gender, age, tumor size, lesion location and histological type (P>0.05). Conclusionp 16 gene methylation modification, which plays an important role in pathogenesis of gastric cancer, can be a biological indicator of reflexing invasion and metastasis of gastric.

KEYWORDS:p16 gene; methylation; gastric cancer; biological indicator

通信作者:張剛, E-mail: zhanggang263@sina.com

基金項目:中國高校醫學期刊臨床專項資金(11521302)

收稿日期:2015-03-23

中圖分類號:R 735.2

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)15-049-03

DOI:10.7619/jcmp.201515014