乙型病毒性肝炎臨床轉歸與機體細胞免疫功能狀況的相關性研究

曾躍紅等

[摘要] 目的 探討乙型病毒性肝炎患者外周血T淋巴細胞亞群、血清干擾素-γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的變化與疾病臨床轉歸的關系。 方法 收集2009年1～12月益陽市中心醫院診治的352例乙肝病毒性肝炎患者，并選擇同期健康人82例作為對照。采用流式細胞儀檢測外周血T淋巴細胞亞群（CD3+、CD4+、CD8+），ELISA法檢測細胞外血清IFN-γ和TNF-α，比較乙肝病毒性肝炎患者與健康人外周血T淋巴細胞亞群及IFN-γ和TNF-α水平。 結果 不同HBV-DNA載量的患者CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IFN-γ和TNF-α水平與健康人比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。急性或亞急性肝衰竭、慢性HBV感染、隱匿性HBV感染患者CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IFN-γ和TNF-α水平與健康人比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。212例HBc-IgM陽性HBV患者經保肝護肝基礎治療（106例）和IFN-α治療（106例）6個月后，患者的CD3+、CD4+、IFN-γ和TNF-α水平仍較健康人顯著升高，差異有統計學意義（P < 0.05），但CD4+/CD8+的比較差異無統計學意義（P > 0.05）。IFN-α治療患者治療6個月和隨訪1、3、5年時，HBV-DNA陰轉率均高于保肝護肝基礎治療患者（P < 0.05）。 結論 乙型病毒性肝炎患者存在細胞免疫功能紊亂，其功能狀態直接影響臨床轉歸，動態監測患者T淋巴細胞亞群和血清IFN-γ、TNF-α對乙型病毒性肝炎的診斷、治療、預后評估及個體化治療都有重要的意義。

[關鍵詞] 乙型肝炎病毒；細胞免疫功能；轉歸

[中圖分類號] R512.62 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）02（b）-0008-05

[Abstract] Objective To explore the correlation between the change of T cell subgroups， serum IFN-γ， TNF-α in patients with hepatitis B and clinical prognosis. Methods From January to December 2009， in the Center Hospital of Yiyang City， 352 patients with hepatitis B were selected， and 82 healthy people were selected as control at the same time. Flow cytometer was used to detect the T cell subgroups （CD3+， CD4+， CD8+）， and the level of serum IFN-γ and TNF-α were detected by ELISA， the results were compared. Results The levels of CD3+， CD4+， CD8+， CD4+/CD8+， IFN-γ and TNF-α in different HBV-DNA capacity patients were compared with those in healthy people， the differences were statistically significant （P < 0.05） The levels of CD3+， CD4+， CD8+，CD4+/CD8+， IFN-γ and TNF-α in acute or subacute liver failure， chronic HBV infection， delitescence HBV infection patients were compared with those in healthy people， the differences were statistically significant （P < 0.05）. 212 patients with HBc-IgM positive HBV were given liver protection basic treatment （106 cases） and IFN-α treatment （106 cases） for 6 months， the CD3+，CD4+，IFN-γ and TNF-α levels were significantly higher than those in healthy people， the differences were statistically significant （P < 0.05）， but the difference of CD4+/CD8+ was not statistically significant （P > 0.05）. HBV-DNA negative rates of patients given IFN-α treatment at 6 months finished， follow-up 1， 3， 5 years were higher than those patients given liver protection basic treatment （P < 0.05）. Conclusion The disorder of cellular immunity in patients with hepatitis B was confirmative. The functional status may to directly affect the hepatitis B prognosis. Dynamic monitoring of the T cell subgroups and serum IFN-γ， TNF-α on hepatitis B patients， which has important clinical significance to diagnosis， treatment， prognosis and individual therapy.

[Key words] HBV； Cellular immune function； Prognosis

乙型肝炎病毒（HBV）是一種嗜肝DNA病毒，人體感染后引起急性、慢性乙型肝炎或成為無癥狀病毒攜帶者，遷延難愈，可發展成為肝硬化、肝癌等[1]，但目前對其發病機制尚未徹底清楚，多數學者認為與免疫應答或免疫調節功能紊亂有關。成人、兒童及幼兒感染HBV后，分別有5%、30%和95%成為慢性HBV感染者，這表明機體免疫成熟程度是決定HBV持續感染的重要因素[2]。因此深入研究其發病機制和感染慢性化的原因，了解不同類型HBV感染者免疫應答的特點與宿主免疫功能之間的關系，探討機體自身細胞免疫功能在乙型病毒性肝炎轉歸中的作用是當前亟需解決的課題。

1 資料與方法

1.1 一般資料

對2009年1～12月益陽市中心醫院（以下簡稱“我院”）診治的HBV感染者進行回顧性流行病學調查后獲得869例血清標本。經乙肝兩對半及熒光定量PCR檢測HBV-DNA檢查，并排除合并其他病毒感染發現，現行HBV感染者352例，其中HBV-DNA陽性209例，HBV-DNA陰性143例；男196例，女156例；年齡1～46歲，平均（29.65±15.28）歲；按不同轉歸[3-4]分：急性或亞急性肝衰竭者96例，急性自限性HBV感染者86例，慢性HBV感染者90例，隱匿性HBV感染者80例。再選擇同期來我院健康體檢者82例作為對照，均無心、肝、肺、腎等重要臟器疾病，經臨床檢查排除炎癥、免疫性疾病和腫瘤，HBV標記測定陰性且肝腎功能正常。其中男42例，女40例；年齡2～50歲，平均（31.17±13.46）歲。兩組年齡、性別比較，差異無統計學意義（t=1.935，P > 0.05）。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法

1.2.1.1 血清病毒學標志物檢測 乙肝五項指標檢測采用ELISA法，試劑由上海科華生物公司生產，操作過程按說明書進行。

1.2.1.2 血清HBV-DNA檢測 HBV-DNA檢測采用熒光定量PCR法，HBV-DNA>1.0×103 copies/mL判定為陽性，試劑由上海萬興生物公司生產，操作過程按說明書進行。

1.2.1.3 流式細胞儀檢測外周血淋巴細胞亞群 采用Beckman-Coulter公司的EPICS -XL型流式細胞儀進行熒光標記抗體檢測。檢測淋巴細胞亞群（CD3+、CD4+、CD8+）所用的單克隆抗體及其組合為：TC-CD3/FITC-CD4/PE-CD8：同型陰性對照分別為Tc-IgG2a/PE-IgG2a/FITC-IgG2a；上述試劑均購自CALTAG公司，操作過程按說明書進行。

1.2.1.4 血清細胞因子檢測 采用ELISA法檢測細胞外血清細胞因子干擾素-γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α），試劑盒購自DIACLONE公司，具體步驟按說明書嚴格操作。

1.2.2 治療方法

HBc-IgM陽性患者依患者經濟狀況及自愿，采用保肝護肝基礎治療，干擾素-α（IFN-α）治療。治療滿6個月后檢測患者細胞免疫功能指標。

1.2.2.1 IFN-α治療 IFN-α 5×106 U，皮下注射，每日1次，2周后改為每周3次。

1.2.2.2 保肝護肝基礎治療 采用降酶、保肝治療。

治療滿3個月者作為觀察統計對象。治療6個月后HBV-DNA陰轉或下降>1.00×105 coples/mL者進入繼續治療組，再治療6個月，治療后隨訪1、3、5年再觀察HBV-DNA陰轉率。最后IFN-α治療106例，保肝護肝基礎治療106例，共212例。

1.3 統計學方法

采用SPSS 16.0對數據進行分析，正態分布計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同HBV-DNA載量患者與健康人細胞免疫狀態的比較

HBV-DNA陽性、HBV陰性患者的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平下降，CD8+、IFN-γ和TNF-α水平顯著性上升，與健康人比較差異有統計學意義（P < 0.05）；同時HBV陰性較HBV-DNA陽性患者的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平增高，CD8+、IFN-γ和TNF-α水平顯著性下降，差異均有統計學意義（P < 0.05）。

2.2 急性或亞急性肝衰竭、急性自限性HBV感染、慢性HBV感染、隱匿性HBV感染與健康人的細胞免疫水平以及細胞因子水平的比較

急性或亞急性肝衰竭、慢性HBV感染、隱匿性HBV感染患者的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IFN-γ和TNF-α水平與健康人比較，差異均有統計學意（P < 0.05）。急性自限性HBV感染者CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+與健康人比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。HBV感染各類型患者的IFN-γ和TNF-α水平較健康人均顯著升高，差異均有統計學意義（P < 0.05）。不同HBV感染類型患者的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、INF-α和TNF-α水平的比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。

2.3 212例HBc-IgM陽性患者行保肝護肝基礎治療、IFN-α治療6個月后與健康人的細胞自身免疫狀態的比較

治療6個月后，患者的CD3+、CD4+、CD8+、IFN-γ和TNF-α水平仍較健康人顯著升高，差異有統計學意義（P < 0.05），但CD4+/CD8+的比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。且兩種治療方案患者的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IFN-α和TNF-α比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。

2.4 212例HBc-IgM陽性患者治療6個月及隨訪1、3、5年時HBV-DNA轉陰情況

治療6個月及隨訪1、3、5年時，IFN-α治療的患者HBV-DNA陰轉率高于保肝護肝基礎治療的患者，差異有統計學意義（P < 0.05）。

3 討論

目前一致認為，HBV感染的發病涉及病毒和機體兩個方面的原因，機體清除HBV而引發細胞免疫病理改變，T細胞是清除HBV和引起機體損傷的重要效應細胞。成人感染HBV后，絕大多數能產生活躍的抗病毒細胞免疫反應，完全消除病毒；新生兒獲得性感染則絕大多數由于對HBV免疫耐受、免疫功能不全等形成慢性感染。人體初次感染HBV以后，主要表現為4種臨床轉歸[3-4]：①急性自限性肝炎；②急性或亞急性肝衰竭；③隱匿性肝炎；④慢性乙型肝炎。HBV急性感染以后，如果機體的細胞免疫和體液免疫應答能很好地清除病毒，急性自限性肝炎是理想的臨床轉歸[4]。研究表明，抗病毒免疫應答功能缺陷是慢性乙型肝炎最重要的特征之一，具體表現為：①固有免疫的損傷；②特異性免疫的損傷；③增強的肝臟免疫耐受。進一步研究證實，HBV感染后，疾病的臨床轉歸與個體的免疫應答強度、寬度和持續的時間密切關聯。因此，在影響乙型肝炎療效的諸多因素中，人體的免疫狀態以及其抗病毒免疫應答在很大程度上決定了HBV感染的臨床轉歸和進展[4-5]。

就宿主而言，機體的免疫狀態、尤其是感染初期的免疫狀態是決定疾病發展的關鍵因素[6]。機體維持正常的免疫功能狀態，有賴于各種免疫細胞（特別是各類T細胞亞群）之間的相互協作/制約，以產生適度的免疫應答，使之既能清除異物抗原，又不致損傷機體自身組織[7]。正常情況下，這些細胞及其亞群的數目在周圍組織中相對穩定，若T細胞總數或CD4+/CD8+ T細胞的比值發生改變，即可視為免疫調節功能異常。HBV感染初期HBV特異性CD8+ T細胞能通過IFN-γ和TNF-α介導非細胞毒性溶解機制完全有效清除HBV病毒而不引起免疫損傷[8-9]，隨CD4+ T細胞數目下降，特異性CD8+ T細胞數目減少、非特異性CD8+ T細胞卻多，破壞肝細胞引起肝臟損傷。細胞因子，特別是IFN-γ及TNF-α有重要作用，目前有研究認為TNF-α與清除HBV DNA及其復制中間體有關[10]；體外實驗證明，采用患者外周血單個核細胞，相當濃度（170 μg/mL）的IFN-γ能抑制離體肝細胞內HBV-DNA復制[11]，IFN-γ可能作為一個細胞活化的標志。本研究結果表明：不同HBV-DNA載量HBV患者CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+水平均低于健康人（P < 0.05），而IFN-γ和TNF-α水平較健康人則顯著升高（P < 0.05）。在急性HBV感染患者外周血中CD3+、CD4+、CD8+、IFN-γ和TNF-α明顯增高（P < 0.05），說明免疫系統的多方面被激活，并可能在病毒清除方面起重要作用，但過強的免疫應答可能會造成大面積的肝臟快速壞死，出現急性或亞急性肝衰竭，預后較差。急性自限性HBV感染患者外周血中CD3+、CD4+、CD8+和健康人比較差異無統計學意義（P > 0.05），但IFN-γ和TNF-α顯著升高（P < 0.05），機體的細胞免疫和體液免疫應答能很好地清除病毒，急性自限性肝炎是理想的臨床轉歸。隱匿性HBV感染患者CD3+、CD4+、CD8+水平稍低于健康人，但差異無統計學意義（P > 0.05），說明這部分人體內沒有活躍的病毒復制，細胞免疫功能尚保持基本正常。慢性HBV感染患者外周血中CD3+、CD4+、CD8+水平顯著減低（P < 0.05），說明慢性乙型肝炎患者體內病毒復制活躍，同時也可引發免疫病理損傷，介導了肝臟炎癥和肝細胞壞死，整體而言，慢性HBV感染者針對HBV的特異性免疫功能受到嚴重抑制[12-13]。由于淋巴細胞是免疫系統行使功能的物質基礎，其數量的顯著下降必然造成功能上的缺陷，這些患者機體應答能力的減弱是造成HBV持續感染的原因。本研究結果提示機體的細胞免疫功能在HBV感染者的轉歸過程中扮演著十分重要的角色。

病毒性肝炎患者機體免疫功能低下，尤其是細胞免疫功能低下，是導致發病和使病情向慢性化轉歸的重要原因。因此，調節機體的免疫功能，尤其是增強細胞免疫功能，是治療本病的重要原則之一。IFN-α是最早運用于抗HBV感染的藥物，INF-α為具有抗病毒和免疫調節功能的細胞因子，因而具有雙重治療功效[13]。IFN-α可通過激活細胞內2'，5'-寡腺苷酸合成酶催化寡核苷酸合成，激活內源性核酸內切酶，以抑制病毒的mRNA信息的傳遞，從而阻止病毒在宿主細胞內繁殖。同時，IFN-a還增強細胞表面白細胞抗原Ⅰ、Ⅱ類分子表達，并通過細胞網絡調節白介素（IL）-1、IL-2、TNF等的水平，促進細胞毒性T淋巴細胞增殖，激活NK細胞、巨噬細胞和功能靶細胞[14]。本研究結果表明，IFN-α治療后及隨訪時的HBV-DNA轉陰率均高于保肝護肝基礎治療（P < 0.05）。IFN-α抗HBV，除了直接降解病毒外，還具有免疫調節作用。因此，通過改善HBV患者細胞免疫功能狀況的IFN-α來清除乙肝病毒是治療HBV最有效方法之一，也是促使HBV感染者向好的方向轉歸的重要途徑。

通過對HBV感染者細胞免疫狀況分析及對疾病的轉歸影響分析，了解宿主細胞免疫狀態與病毒間的調變關系及在慢性HBV感染中宿主免疫指標的消長規律。不僅完備了流行于我國的HBV的基礎和臨床資料，還對闡明HBV的發病機制，對指導臨床診斷、治療和預后以及預防工作都具有極其重要的理論意義和實用價值。本研究由于得到的只是一個橫斷面的資料，無法進行縱向研究，沒有對HBV不同血清學模式與免疫功能狀況之間的關系進行更進一步的研究，對不同細胞免疫功能狀況在HBV轉歸的血清學模式的復雜作用規律，不能得到更精確的結論。但是不難得出，在HBV感染中，活躍的多克隆細胞免疫反應是必不可少的，機體細胞免疫功能狀況是HBV患者轉歸的關鍵。

[參考文獻]

[1] World Health Organization. Hepatitis B [EB/OL]. http：//www.who.int/ mediacentre/factsheets/en.

[2] Chisari FV，Ferrari C. Hepatitis B virus immunopathogenesis [J]. Annu Rev Immunol，1995，13：29-60.

[3] Wang FS. Clinical immune characterization of hepatitis B virus IFNection and implications for immune intervention：progress and challenges [J]. Hepatol Res，2007，37（Suppl 3）：S339-S346.

[4] Zhang Z，Zhang JY，Wherry EJ，et al. Dynamic programmed death 1 expression by virus-specific CD8 T cells correlates with the outcome of acute hepatitis B [J]. Gastroenterology，2008，134（7）：1938-1949.

[5] 李彩東，吳斌，陳錫蓮，等.不同病毒載量HBV感染者外周血T淋巴細胞亞群和轉化生長因子β的變化及意義[J].臨床肝膽病雜志，2014，30（9）：882-886.

[6] Baumert TF，Thimme R，von Weizs？覿cker F. Pathogenesis of hepatitis B virus IFNection [J]. World J Gastroenterol，2007，13（1）：82-90.

[7] 張群，龐國進，諶雙君，等.慢性乙肝患者CD4+CD25+T細胞對外周血樹突狀細胞成熟的作用[J].臨床和實驗醫學雜志，2014，13（8）：601-607.

[8] Phillips S，Chokshi S，Riva A，et al. CD8+ T cell control of hepatitis b virus replication： direct comparison between cytolytic and noncytolytic functions [J]. J Immunol，2010， 184（1）：287-295.

[9] 鄭智鑫，陳黎明，孔霜嬋，等.慢性重型乙肝血清病毒水平與病情及預后關系研究[J].中國醫藥導報，2013，10（3）：55-56，63.

[10] 周燕飛，龔杰，張曉梅，等.慢性乙型肝炎HBV-DNA載量與炎性因子、肝臟酶學指標的相關性研究[J].疑難病雜志，2014，13（8）：804-806.

[11] Suri D，Schilling R，Lopes AR，et al. Non-cytolytic inhibition of hepatitis B virus replication in human hepatocytes [J]. J Hepatol，2001，35（6）：790-797.

[12] 王福生.慢性乙型肝炎的免疫調節治療：挑戰與機遇[J].傳染病信息，2008，21（4）：200-202.

[13] 田豫萍.α-干擾素聯合恩替卡韋治療慢性乙型肝炎的效果觀察[J].中國現代醫生，2014，52（21）：22-24.

[14] 趙麗紅，任玉新.抗乙肝病毒藥物的研究進展[J].醫學理論與實踐，2008，21（10）：1155-1157.

（收稿日期：2014-11-11 本文編輯：蘇 暢）