幽門螺桿菌對常用抗菌藥物的耐藥性研究*

吳李培，周玉貴，王 敏，馬榮國，茅 敏，周 麗，趙建春，宣世海

(南通大學附屬東臺醫院檢驗科，江蘇東臺 224200)

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·論 著·

幽門螺桿菌對常用抗菌藥物的耐藥性研究*

吳李培，周玉貴，王 敏，馬榮國，茅 敏，周 麗，趙建春，宣世海△

(南通大學附屬東臺醫院檢驗科，江蘇東臺 224200)

目的 調查東臺地區幽門螺桿菌對5種常見抗菌藥物的耐藥性及其變化趨勢。方法 收集來自該院胃鏡室150例胃黏膜組織接種于含有選擇性抑制劑的哥倫比亞血瓊脂平板，微需氧條件(5%O2,10%CO2,85%N2)下培養3～5 d,分離培養出78株幽門螺桿菌，所有菌株均采用E-test法進行藥物敏感性試驗。結果 幽門螺桿菌對四環素、甲硝唑、左氧氟沙星、克拉霉素和阿莫西林的耐藥率分別為3.8%、84.6%、48.7%、30.8%和7.7%。結論 該地區幽門螺桿菌對甲硝唑的耐藥率較高，應謹慎使用。對左氧氟沙星和克拉霉素的耐藥率相對較高，可與阿莫西林聯合使用以提高根除效果。

幽門螺桿菌; 耐藥; 抗菌藥物; 聯合用藥

幽門螺桿菌是慢性胃炎、消化性潰瘍的主要致病因子之一,與胃癌、胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤及一些胃腸外疾病關系密切,已被世界衛生組織列入Ⅰ類致癌原。幽門螺桿菌根除治療方案很多，其中質子泵抑制劑加兩種抗菌藥物的三聯療法仍是當前國內、外公認的一線治療方法。然而，隨著抗菌藥物在臨床上的廣泛使用,幽門螺桿菌的耐藥菌株也日益增加。既往研究發現，對消化性潰瘍合并幽門螺桿菌感染的患者進行幽門螺桿菌根除治療，不僅有助于潰瘍的治愈、減少潰瘍的復發率，還可降低患胃癌及胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤的風險[1]。因此，了解幽門螺桿菌的耐藥性有助于根除幽門螺桿菌。為此，本研究對江蘇東臺地區就診的部分胃病患者進行幽門螺桿菌的分離培養和5種常見抗菌藥物敏感性試驗,旨在調查本地區幽門螺桿菌對5種常見抗菌藥物的耐藥性,為臨床合理用藥提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 150例胃黏膜標本取自2013年5月至2014年5月本院消化內科進行胃內窺鏡檢查的消化性潰瘍患者，其中，男92例，女58例；平均年齡40.3歲。以上疾病的診斷標準依照《內科學》[2]。本研究經本院倫理委員會批準，且所有患者均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 選擇性抑制劑、氧化酶試劑(英國OXOID)，過氧化氫溶液(天津藥業集團新鄭股份有限公司)，哥倫比亞瓊脂、微需氧產氣袋、四環素、甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林和左氧氟沙星E-test試紙條及密封培養罐(法國梅里埃)，脫纖維綿羊血(溫州市康泰生物科技有限公司)，幽門螺桿菌快速診斷試劑盒(尿素酶法)購自上海惠泰醫療科技公司，H.pylori標準菌株26695(上海市消化病研究所)。

1.3 方法

1.3.1 H.pylori分離培養 無菌條件下取出胃黏膜組織，2 h內接種于含有選擇性抑制劑的哥倫比亞培養基，反復將組織各面涂抹在培養基的表面，盡量使組織多面接觸培養基。將接種好的哥倫比亞培養基迅速置于培養罐中，快速將微需氧產氣袋放入密封培養罐，將培養罐置于恒溫培養箱35 ℃培養3～5 d后，觀察結果。

1.3.2 菌株鑒定 挑取可疑菌落，涂片染色鏡檢呈革蘭染色陰性，菌體細長彎曲呈螺形、S形或海鷗形。菌體一端或兩端可有多根帶鞘鞭毛，運動活潑。打開蓋子，觀察培養皿內菌落形態，挑取優勢菌落或者疑似菌落做革蘭染色，革蘭染色陰性菌落再分別做尿素酶、氧化酶和過氧化氫試驗，三種試驗陽性即鑒定為幽門螺桿菌。挑取陽性菌落轉種，進行四區劃線純培養1～2 d，以獲得單個菌落。

1.3.3 幽門螺桿菌藥敏試驗 用無菌棉簽蘸取細菌，配置細菌懸液，校正菌液水平相當于2個麥氏單位。用無菌棉簽蘸取菌液，在管內壁將多余的菌液旋轉擠去后，在M-H瓊脂表面均勻接種3次，每次旋轉平板60°，最后沿平板涂抹1周。平板置室溫下干燥3～5 min，用無菌鑷子將E-test試紙條貼于瓊脂表面。將平板迅速置于培養罐中，快速將微需氧產氣袋放入密封培養罐并蓋好，將培養罐置于恒溫培養箱35 ℃培養3～5 d后，觀察結果。

1.4 判斷標準 判斷標準依據說明書，甲硝唑、四環素、克拉霉素和左氧氟沙星：<2 μg/mL為敏感，≥2～≤8 μg/mL為中介，>8 μg/mL為耐藥；阿莫西林：<8 μg/mL為敏感，≥8～≤16 μg/mL為中介，>16 μg/mL為耐藥；以標準菌株26695作為質控菌株。

2 結 果

2.1 幽門螺桿菌菌株的分離培養及鑒定 150例胃黏膜標本成功分離培養出幽門螺桿菌菌株78株,經生化反應(觸酶、氧化酶和尿素酶)三者均陽性,表明78株菌株均符合幽門螺桿菌鑒定標準。

2.2 幽門螺桿菌藥敏試驗結果 5種抗菌藥物藥敏試驗結果比較，見表1。

表1 幽門螺桿菌菌株對5種抗菌藥物體外藥物敏感性

3 討 論

幽門螺桿菌感染率已達全球人口的50.0%以上，且發展中國家感染率稍高[3-4]。中國也是一個幽門螺桿菌感染率較高的國家，為42.0%～90.0%[5]。本地區幽門螺桿菌感染率52.0%，在國內處于較低水平。

關于幽門螺桿菌感染的治療一直是廣大胃腸病工作者關注和研究的熱點，而在幽門螺桿菌感染治療中關鍵問題在于其對抗菌藥物的耐藥性,幽門螺桿菌對抗菌藥物耐藥是導致幽門螺桿菌根除失敗的主要原因。本研究結果顯示，本地區幽門螺桿菌對甲硝唑的耐藥率高達84.6%，明顯高于西安、福州地區[6]。分析原因可能與甲硝唑在胃內具有高穩定性和高活性有關。幽門螺桿菌對甲硝唑的耐藥機制比較復雜,目前多數研究認為與rdxA基因及frxA基因突變有關[7-8]。本試驗結果顯示，幽門螺桿菌對克拉霉素和左氧氟沙星的耐藥也較為嚴重，耐藥率分別為30.8%、48.7%。本地區克拉霉素的耐藥率與全國中心報道相似，略高于本課題組2010年報道的25.0%[9-10]。幽門螺桿菌對克拉霉素的耐藥機制與幽門螺桿菌23S rRNA基因突變有關，但存在區域差異，最常出現A2143G、A2142G、A2144G、A2142C的突變。本項目組以往研究發現，江蘇東臺地區耐克拉霉素幽門螺桿菌菌株的23S rRNA突變以A2143G為主[11]。本地區左氧氟沙星的耐藥率明顯高于香港、上海地區，與北京地區差別不大[12-14]。其耐藥機制與gyrA基因突變有關，其氨基酸突變形式主要為ASn-87、Asp-91。阿莫西林和四環素的耐藥率較低，與本課題組2008年報道的阿莫西林耐藥率相比，雖略有升高，但相對于其他抗菌藥物，其耐藥還處于較低水平。這可能與幽門螺桿菌并非通過產生β-內酰胺酶而對阿莫西林耐藥的特殊機制有關。

2012年“第四次全國幽門螺桿菌共識會議——井岡山共識” 推薦根除方案：鉍劑+質子泵抑制劑+兩種抗菌藥物組成的四聯療法。抗菌藥物組成方案有4種：阿莫西林+克拉霉素；阿莫西林+左氧氟沙星；阿莫西林+呋喃唑酮；四環素+甲硝唑或呋喃唑酮。本研究結果顯示，本地區幽門螺桿菌對甲硝唑的耐藥率較高(84.6%)，應謹慎使用。對左氧氟沙星和克拉霉素的耐藥率相對較高，可與阿莫西林聯合使用以提高根除效果。

綜上所述，本地區用于根除幽門螺桿菌5種常見抗菌藥物的耐藥率高于其他地區。本試驗結果顯示，阿莫西林可作為本地區根除幽門螺桿菌的一線治療藥物。因此，在根除幽門螺桿菌前，檢測其常見抗菌藥物的耐藥性對于臨床醫生合理使用抗菌藥物、避免幽門螺桿菌耐藥菌株的產生有著重要的臨床意義。

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Research on resistance of Helicobacter pylori to commonly used antibacterial drugs*

WULi-pei,ZHOUYu-gui,WANGMin,MARong-guo,MAOMin,ZHOULi,ZHAOJian-chun,XUANShi-hai△

(DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedDongtaiHospitalofNantongUniversity,Dongtai,Jiangsu224200,China)

Objective To investigate the resistance and change trend of Helicobacter pylori to five kinds of common used antibiotic drugs in the Dongtai area of Jiangsu province.Methods One hundred and fifty biopsy specimens from the gastroscope room of this hospital were cultured on Columbia sheep blood agar containing elective inhibitor under microaerobic condition(5%O2,10%CO2,85%N2) for 3-5 d,78 strains of helicobacter pylori were isolated,cultured,and performed the drug susceptibility test.Results The resistance of isolated helicobacter pylori strains to tetracycline,metronidazole,levofloxacin,clarithromycin and amoxicillin were 3.8%,84.6%,48.7%,30.8% and 7.7%,respectively.Conclusion Helicobacter pylori in local area has the higher resistance to metronidazole,so metronidazole should be carefully used.Helicobacter pylori has relatively higher resistance to levofloxacin and clarithromycin,therefore which could be used by combining with amoxicillin for improving the eradication effect.

Helicobacter pylori; drug resistance; antibiotics; combination medication

江蘇省衛生和計劃生育委員會科研課題(Z201527)；江蘇省鹽城市科技計劃項目(YK2014088)。

吳李培，男，碩士，主管檢驗師，主要從事細菌耐藥基因研究。△

，E-mail:xsh.jyk@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.17.008

A

1672-9455(2015)17-2503-02

2015-03-10

2015-03-15)