改良血栓栓塞法建立家兔腦血栓模型的實驗研究*

堯雪洲，李國暉，楊 燕，許 軔

(1.云南中醫學院機能實驗室,昆明 650500；2.云南中醫學院第一附屬醫院放射科,昆明 650021;3.云南藝術學院圖書館,昆明 650500)

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·論 著·

改良血栓栓塞法建立家兔腦血栓模型的實驗研究*

堯雪洲1，李國暉2，楊 燕2，許 軔3

(1.云南中醫學院機能實驗室,昆明 650500；2.云南中醫學院第一附屬醫院放射科,昆明 650021;3.云南藝術學院圖書館,昆明 650500)

目的 采用改良的血栓栓塞法建立家兔腦血栓模型，并引入CT技術等對模型進行觀察與評價。方法 將12只家兔隨機分為偽手術組和建模組兩組，導管自家兔頸外動脈逆行至頸內動脈，偽手術組注入生理鹽水，建模組借助導絲注入經過體外處理的線狀長血栓；術前與術后行CAT檢查對照，并于術后各時間點觀察行為障礙評分及頭顱NCCT測量CT值進行對照。結果 建模組手術前后相比較，術后4 h CTA顯示建模組6例均成功置入自頸內動脈中段至大腦中動脈的血栓子；術后對動物進行行為學評分及顱腦NCCT檢查，兩組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。結論 該模型簡便易行，血栓位置穩定，血栓成分與臨床類似，對動物損傷相對較小，重復性好，是一種較為理想的醫學實驗動物腦血栓模型。

腦血栓模型； 血栓栓塞法； 實驗動物模型

建立一種栓塞位置比較穩定、能模擬人類腦血栓的動物模型，對腦血栓類疾病、溶栓治療、出血相關因素及超過溶栓時間窗治療的研究具有重要價值。本實驗研究及借鑒了目前流行的制作方法，并對建模方法及模型的評價指標進行了改進,得到了一個易于觀察評價，栓塞部位及梗死范圍穩定的家兔腦血栓模型，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料 家兔12只，雌雄不限，體質量(2.0±0.3)kg，由昆明醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK(滇)K2011-0011。術前10 h禁食，5 h禁飲。編號后隨機抽號分為2組，即偽手術組(1組)與建模組(2組)。

1.2 儀器與試劑 GE Light Speed 128層螺旋CT，西門子公司生產；高溫消毒鍋，型號LDZX-50KBS，上海申安公司生產；一次性麻醉導管，貴州天地藥業有限公司生產；靜脈留置針，型號32A,德國貝朗公司生產；恒溫箱；金屬銀導絲；麻醉喉鏡，兒童型；一次性氣管插管，3.5號；烏拉坦，百塞勤化學技術(上海)有限公司生產(批號20120308)；造影劑碘海醇注射液(歐乃派克350 mg/L)，美國GE公司生產；注射用青霉素鈉，中諾藥業有限公司生產；凝血酶Thrombin,品牌sigma。

1.3 方法

1.3.1 建模手術 兔耳緣靜脈緩慢注射烏拉坦1 mg/kg(25%,4 mL/kg)麻醉。麻醉后將家兔呈頭部過仰臥位固定在兔手術臺上，在麻醉喉鏡輔助下氣管插管。手術部位備皮，消毒鋪巾后取頸前正中切口，于下頜角內側舌骨水平分離出右頸總動脈(CCA)，切斷該側舌骨肌，于頸動脈膨大處分離頸內動脈(ICA)、頸外動脈(ECA)，結扎ECA各分支；CCA近心端及ICA遠心端用動脈夾阻流，自頸ECA逆行插管至CCA內。取血1 mL；將血液加入抗凝劑適量后放入恒溫箱內老化10 min，制成約長10.0 mm、直徑0.2 mm的自體血栓；絲線牽拉ECA向下以減小ECA與ICA的夾角(形成鈍角)，小心地插入套管大約35 mm(從頸總動脈分叉處計算),此時套管頭端距離大腦中動脈(MCA)起始處2～3 mm，盡量接近MCA起始。建模組借助金屬銀導絲注入自體血栓，偽手術組注入生理鹽水。術畢逐層縫合，肌注青霉素(40萬單位/只)。

1.3.2 CTA造影 術后4 h對建模組與偽手術組所有家兔行頭頸部血管CT血管造影(CTA)，并進行對比。成像方案為家兔麻醉仰臥位，碘海醇注射液(歐乃派克350 mg/L)，耳緣靜脈直接注入，劑量12～16 mL(約4.9～6.6 mL/Kg)，灌注后70 s的延時掃描(DCT)，CT全腦灌注成像(PWCT)作為CTA源圖重建CTA，判斷顱內大血管阻斷或狹窄及分支缺損情況。

1.3.3 行為障礙評分 參考Langa和Bederson的方法，改良后的評分標準為：滿分為12分,分數越高,動物的行為障礙越嚴重。于術前及術后8、12 h對動物進行評分。計分規則如下:(1)家兔至地面，觀察其行走情況。行為完全正常者，記0分；無神經損傷癥狀0分；向手術對側傾斜者記1分；向對側傾倒2分；損傷嚴重，已無法自主活動者記3分；昏迷、意識喪失4分。(2)將動物置于平地面上，分別推雙肩向對側移動；觀察兩側抵抗力有無差異；檢查阻力；觀察兩前肢的肌張力。如雙側阻力對等且有力,計為0分；如向手術對側推動時阻力下降者，根據下降程度不同分為輕、中、重3度,分別計為1、2、3分；昏迷、意識喪失4分。(3)提家兔后肢離開地面約1尺，將動物兩前肢置一金屬網上，觀察兩前肢屈曲情況：如雙前肢對稱伸向地面,計為0分。對側有前肢內收或肩內旋者，記1分;不能完全伸展對側前爪 2分；既有腕、肘的屈曲又有肩內旋不能完全伸展對側前爪者計3分，昏迷4分。

1.3.4 頭顱NCCT 術前及術后12 h所有家兔(仰臥位)采用顱腦常規非強化CT(NCCT，Noncontrast CT)。掃描方案為：電流100～400 mV，自顱底區向上掃描至顱頂，層厚1.25 mm，電壓100 kV，掃描時間3.34 s。3名放射科高年資醫師，按照Alberta Stroke Program Early CT Score (ASPECTS)標準，進行大腦中動脈供血區分析。ASPECTS分區的每個區域分別按照影像學表現分為正常區、腦質密度降低區和水腫區。分別測量建模組梗死灶及偽手術組相對應區CT值。

1.4 統計學處理 采用SPSS19.00生物統計學軟件。兩實驗組術前顱腦NCCT值，采用獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05；兩實驗組術后8、12 h生物學行為評分數據及術前與術后12 h NCCT測量的CT值均采用了多組重復測量資料的方差分析,檢驗水準α=0.05。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 建模前、后家兔頭頸部CTA結果

2.1.1 術前CTA對家兔頭頸部血管的觀察 主動脈弓造影顯示家兔的弓上血管呈2分支結構，左右側頸總動脈與鎖骨下動脈起始部共干。術前家兔CTA結果表明，家兔的頭頸血管結構比較穩定，本次實驗中未見明顯變異結構，與人類頭頸部血管結構具有較好相似性和可比性。見圖1。

2.1.2 建模手術后4 h CTA結果 血栓栓塞組6例均顯示頸內動脈明顯狹窄，頸內動脈內至大腦中動脈內有血栓形成。該結果提示，術后4 h，經過手術植入的血栓子穩定，未溶解，未見出血等其他并發癥。見圖2。

圖1 CTA術前顯示家兔頭頸部血管

圖2 CTA顯示建模后家兔血栓栓塞

2.2 行為學障礙評分結果

2.2.1 術前，實驗動物行為障礙評分兩組均為0分，組間差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 術后8、12 h兩組家兔行為學評分

2.2.2 術后8、12 h，家兔蘇醒后均表現出不同程度行為障礙。Mauchly的球形度檢驗，不拒絕球形假設(P=0.687)；不同時間行為學評分差異有統計學意義(P=0.00)；動物分組處理因素與時間的交互作用有統計學意義(P=0.00)；動物分組處理差異有統計學意義(P=0.00)。該結果提示，在不同處理組間，不同觀察點觀察，實驗動物的行為學表現差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.3 術前及術后12 h NCCT頭顱平片的變化

2.3.1 術前顱腦NCCT，兩組12只家兔雙側CT圖像腦組織均勻對稱，術前CT值均值約為(27.76±5.07)，兩組家兔腦CT值差異無統計學意義(P=0.863)。見表2。

2.3.2 術后12 h 顱腦NCCT，建模組家兔術后12 h CT平掃可發現以下3個征象：(1)腦動脈高密度征；(2)局部腦腫脹；(3)腦實質密度降低。同時本組4例CT圖有低密度改變或灰白界限不清,輕度腦溝展平等表現。建模組患側腦CT值明顯下降提示腦缺血，而偽手術組從CT值觀察亦略有上升，見表2，考慮由于手術等所致腦供血不足或輕度腦水腫所致。建模手術前與建模手術后12 h,CT結果顯示，家兔建模組球腦密度下降，對比偽手術組時間，差異有統計學意義(P=0.00)；分組與時間的交互作用差異有統計學意義(P=0.00)。分組處理間差異有統計學意義(P=0.02)。

表2 術前及術后12 h測量家兔腦組織CT值

3 討 論

在目前各類腦血栓模型的眾多建模方法中，血栓栓塞法是其中公認最適合溶栓治療研究需要的。大鼠是目前國際上制作各種腦梗死模型中最常用的動物[1]。但大鼠是無腦回動物，其腦組織和血管解剖以及腦白質和灰質的比例等與人類差別較大；鼠的腦體積較小，對建立模型的技術及評價的設備條件要求高。另外，很多臨床中應用的診斷和治療方法也難以在鼠模型上驗證。因此腦組織較大靈長類、豬、犬等動物模型也越來越多地被應用到腦梗死實驗研究中。靈長類動物無疑是研究人類腦血管疾病的最佳選擇，但倫理學和經濟學上的問題都限制了該類動物的廣泛應用[2]。國內有學者報道用幼豬、犬等制作腦血管模型并用于溶栓研究。但豬ICA入顱前在顱底破裂孔近端形成由小血管組成的網狀結構，與人類解剖結構差異較大[3]。故本次實驗中采用家兔作為實驗動物，家兔性格溫順，有相對較大的靶器官，其腦體積和血管直徑變異較小，在一定范圍內與體質量沒有相關性，穩定性較好；能采用在人體普遍適用的方法及設備進行檢查評估。

過去血栓模型主要采用2種類型的血栓，即懸浮血栓(微血栓)和經過精細切割的血栓。由于選用懸浮血栓(微血栓)容易誘發DIC且栓塞部位不穩定，而精細切割血栓對實驗條件及設備要求較高[4]。故本次實驗中將血栓子改良為線狀血栓，0.2 mm×10.0 mm，容易制作，且比較容易控制栓塞部位。

過去對腦血栓動物模型的評價指標主要選擇病理學指標及行為學評分，具有明顯的局限性[5-6]。本實驗引入CT平掃及CTA技術進行模型的評價，雖然CT平掃不能準確判斷半暗帶和缺血核區，但對12 h后的腦缺血性疾病CT平掃結果提示患側密度下降，腦組織腫脹。本實驗中家兔大腦梗死灶均由CTA及CT平掃證實，行為學評分也比較穩定，表明此模型穩定、重復性好。

筆者認為本實驗中建立的腦血栓家兔模型，主要存在2個問題。第一，采用烏拉坦做靜脈全麻，時間較長且對腦組織的血氧流量等有明顯影響[7-8]。如果采用短效麻醉藥復合試劑靜脈滴注，如芬太尼和瑞芬太尼復合靜脈麻醉等，可以減少麻醉的干擾。第二，普通CT平掃檢測，難以進行12 h內的早期診斷。而CT灌注成像能夠在腦血栓早期的6 h內進行有效的準確判斷[9-10]。故如果需要對腦血栓早期(12 h內)進行建模研究，在選擇觀察評價指標時應該采用CT灌注代替NCCT。

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Experiment research of improved thromboembolism method for establishing rabbit cerebral thrombosis model*

YAOXue-zhou1,LIGuo-hui2,YANGYan2,XURen3

(1.FunctionalLaboratory,YunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Kunming,Yunnan650500,China;2.DepartmentofRadiology,FirstAffiliatedHospital,YunnanCollegeofTraditionalChineseMedicine,Kunming,Yunnan650021,China;3.Library,YunnanArtUniversity,Kunming,Yunnan650500,China)

Objective To establish the rabbit cerebral thrombosis model by the improved thromboembolism method,and to introduce the CT technology for observing and evaluating this model.Methods 12 rabbits were randomly divided into the sham operation group and the model group.The catheter was retrogradely inserted from the external carotid artery to internal carotid artery.The sham operation group was injected by normal saline;the model group was injected by linear long thrombosis with the help of guiding wire.The CTA contrastive examinations was performed before and after operation;the scores of behavior disorder were observed at various time points after operation and the cranial NCCT measurements were contrasted.Results In the comparison between before and after operation in the model group,CTA at postoperative 4 h displayed that 6 cases were succeeded in placing the thrombosis from the middle section of internal carotid artery to middle cerebral artery;the behavior score and craniocerebral NCCT examination were performed after operation,the differences between the two groups were statistically significant(P<0.05).Conclusion The model is simple,easy to operate,has the stable thrombosis location,the thrombus constituents are similar to clinic,the animal injury is relatively small,the repeatability is good,which is an ideal cerebral thrombosis model of medical experimental animal.

cerebral thrombosis model; thromboembolism method; experimental animal model

云南省教育廳科學研究基金項目(2012Y065)。

堯雪洲，女，碩士，實驗師，主要從事機能實驗科學、神經生理學研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.17.009

A

1672-9455(2015)17-2505-03

2015-03-25

2015-04-15)