21-羥化酶缺陷癥基因診斷方法的建立及應用

張 麗，焦 凱，張 菊

(第四軍醫大學唐都醫院內分泌科，西安 710038)

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·論 著·

21-羥化酶缺陷癥基因診斷方法的建立及應用

張 麗，焦 凱△，張 菊

(第四軍醫大學唐都醫院內分泌科，西安 710038)

目的 建立一種熒光偏振檢測技術聯合直接測序法診斷先天性腎上腺皮質增生癥中21-羥化酶缺陷癥的新方法，并對中國人群中最常見的2種基因缺失和8種點突變進行檢測。方法 收集40例健康者及2例患者外周血，提取基因組DNA。設計通用引物，同時擴增CYP21A2和CYP21A1P等位基因片段，然后用序列特異的TAMRA熒光標記探針對擴增產物進行雜交檢測，利用熒光偏振儀檢測擴增雜交的熒光偏振值，確定是否存在該基因的缺失，同時用直接測序法驗證檢測結果；對Exon3 Del 8 bp(GAGACTAC)缺失進行檢測時，將缺失的8個堿基設計在引物上，確保引物的特異性。同時根據CYP21A2基因與其假基因序列差異，設計5對特異性引物擴增CYP21A2基因，PCR后直接測序檢測中國人群中最常見的8種點突變，包括P30L、i2g、I172N、E6Cluster、V281L、920-921insT、Q218X、R356W。結果 熒光偏振法未檢測到CYP21A2基因大片段缺失，檢測結果與直接測序法結果對比差異無統計學意義(P>0.05)，一致率達100%，40例健康者未檢測到點突變，1例患者檢測出Exon1 G56R,Exon7c.920-921InsT插入雜合突變，1例患者檢測出Exon4I172N、Exon8Q318X雜合突變。結論 熒光偏振檢測法聯合直接測序法診斷21-OHD是一種高效的檢測手段，可以廣泛用于臨床，不僅能對患者基因突變類型進行分析，在指導遺傳咨詢及產前診斷方面亦發揮重要作用。

先天性腎上腺皮質增生癥； 21-羥化酶缺乏癥； 熒光偏振； CYP21A2基因

先天性腎上腺皮質增生癥(CAH)是一組由于腎上腺皮質激素合成途徑中的必需酶基因的缺陷所引起的一種常染色體隱性遺傳病，是引起兩性畸形最常見的病因[1]。其中，90%～95%的CAH由21-羥化酶基因缺陷所致[2]。由21-羥化酶缺陷引起的先天性腎上腺皮質增生癥的發病率為1∶16 000～1∶20 000，如果沒有早期診斷及治療，CAH會導致休克，低血鈉及高血鉀，從而引起新生兒死亡。在美國及其他一些發達國家，CAH列入新生兒疾病篩查目錄[3]。目前對于21-羥化酶基因缺陷征(21-OHD)的診斷主要是通過臨床癥狀和生化檢測，此方法不僅存在容易發生誤診或漏診的弊端,而且無法對患者的基因型進行分析。因此對CAH開展分子診斷非常有必要，不僅能為臨床提供明確的診斷依據，還可避免發生誤診和漏診。本試驗采用熒光偏振方法聯合直接測序法對中國人群中21-OHD患者常見的10種突變進行檢測，分別為30 kb 缺失，Exon1,P30L(CCG→CTG)，Intron2,nt656A/C>G(i2g)，Exon3,nt707-714 del (△8bp GAGACTAC)，Exon4,I172N(ATC→AAC)，Exon6,簇狀突變，Exon7,V281L,nt1757 ins T，Exon8,Q318X，R356W,通過檢測以驗證本方法的準確性，特異性及臨床可實施性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年5～10月在第四軍醫大學附屬唐都醫院內分泌科就診的患者，在知情同意的原則下，取患者外周血5 mL(本研究中所有患者及健康對照組人員均簽署知情同意書)。嚴格按照TIANamp Blood DNA Kit說明書按步驟提取DNA,用紫外分光光度計測定產物DNA的濃度和純度，置于-20 ℃保存。

1.2 儀器與試劑 熒光偏振檢測儀 Victor2 Wallac 1420(Perkin Elmer),verti 96well PCR擴增儀(東勝創新生物科技公司),臺式離心機(德國Eppendorf公司)，恒溫水浴鍋(美國思伯明公司)，凝膠成像儀,穩壓電泳儀(美國Thermo公司)。血液基因組DNA提取試劑盒(Tiangen)，pUCm-T載體，Taq DNA 多聚酶,普通質粒小提取試劑盒,DNA膠回收試劑盒(sangon)等。

1.3 方法

1.3.1 熒光偏振檢測法 (1)引物與探針設計：根據GenBank 確定CYP21A2及CYP21A1P的基因片段序列，按照引物設計原則，結合熒光偏振反應的特殊要求設計引物和探針(見表1)，并由上海生工有限公司合成。(2)標準品的構建：用特異性引物將獲得的DNA進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳后將目的片段切下進行膠回收，回收后的產物與PUCm-T載體進行連接并轉化入DH5α感受態細胞中，挑取單克隆后構建重組質粒，同時測序驗證。將只載有CYP21A1P序列的質粒用作陽性標準品，同時載有CYP21A2和CYP21A1P的質粒用作陰性標準品。使用PUCm-T空載體分別作為以上兩個標準品的陰性對照。(3)建立熒光偏振的檢測反應：熒光偏振檢測反應體系為(25 μL):10×PCR Buffer(含MgCl2)2.5 μL，4×dNTPs 0.5 μL,上下游引物(10 μM)各0.5 μL，探針(5 μM)0.25 μL,DNA模板2.5 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，去離子水17.75 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環，72 ℃延伸3 min。將構建的兩個標準品質粒按濃度梯度分別進行稀釋，從1.0×107copy/μL稀釋至1.0 copy/μL，與PUCm-T陽性標準品、陰性標準品以及樣本分別按以上條件進行檢測，每個標本均設置副孔。(4)熒光偏振檢測與直接測序法對比：將熒光偏振檢測的樣本同時進行PCR后送測序，對比兩者檢測結果的一致性，同時驗證熒光偏振法的靈敏性和特異性。

表1 熒光偏振檢測分析的通用引物及探針

1.3.2 點突變的檢測 針對要檢測的CYP21A2基因上的點突變設計特異性引物,見表2，共進行5個PCR擴增反應。其中，第二對引物針對CYP21A2基因外顯子3的特殊序列將與CYP21A1P相區別的8個堿基設計在引物上，保證了引物的特異性(下劃線)。點突變PCR反應體系(25 μL):10×PCR Buffer(含MgCl2)2.5 μL，4×dNTPs 2 μL,上下游引物(10 μM)各1 μL,cDNA模板5 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，去離子水13 μL。PCR反應條件95 ℃預變性5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環，72 ℃延伸3 min。引物1 Tm為59 ℃，引物2和引物3 Tm為61 ℃，引物4和引物5 Tm為58 ℃，其余反應條件均一致。將擴增的大小不同的片段送上海生工公司進行測序，并且與GenBank對比，檢測點突變。直接測序結果不滿意者可進行克隆后再測序。

表2 擴增CYP21基因的PCR引物

注：CYP21A2標準參照序列為GenBank,GeneID 1589，NG_007941.2；CYP21A1P標準參考序列為GeneID 1590，AL645922.12;起始密碼子ATG中A的核苷酸位置定為1。

1.4 統計學處理 熒光偏振法及測序法之間的比較采用χ2檢驗，統計經SPSS19.0軟件處理，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 標準品的驗證 將PCR擴增的目的片段經1%瓊脂糖凝膠電泳進行驗證，紫外光凝膠成像系統可見到213 bp大小的目的片段條帶。同時，重組質粒送上海生工公司測序，測序結果與GenBank序列一致。

2.2 熒光偏振檢測反應的FP臨界值的建立 對熒光偏振檢測反應所得的FP值用t檢驗，可以發現陽性對照的FP值分布與陰性對照的FP值存在顯著差異。在Victor2 Wallac熒光偏振檢測儀分別于激發光波長535 nm、吸收波長590 nm檢測每個對照品及樣本反應產物的TMARA熒光偏振值(FP)，以mp為單位。空白對照TMARA為(236.3±6.9)mp，CYP21A2缺失TAMRA為(116.8±6.2)mp，CYP21A2TAMRA未缺失為(222.6±5.8)mp。

2.3 熒光偏振法與直接測序法比較 Fisher精確概率法得兩種方法檢測效率差異無統計學意義(P=0.753)。兩者符合率達到100%。熒光偏振檢測結果2例患者熒光偏振檢測FP值分別為228、232 mp，檢測結果為陰性,表明未發生CYP21A2基因的缺失。

2.4 點突變的檢測 健康對照者均未檢測出基因突變。2例患者，男性患兒基因突變類型為G56R/920-921insT雜合突變，女性患兒基因突變分析提示為I172N/Q318X雜合突變。

3 討 論

先天性腎上腺皮質增生癥是最常見的遺傳性疾病之一，常見的潛在突變存在于編碼21-羥化酶的基因中，占CAH的90%～95%。其他能引起缺陷的酶還包括11β-羥化酶、17α-羥化酶、3β-類固醇脫氫酶等。21-羥化酶是腎上腺類固醇激素合成的關鍵酶之一，也稱為CYP21或P450c21，是存在于腎上腺皮質內質網中的一種細胞色素P450酶，主要的生物作用是將孕酮和17-羥孕酮轉化為脫氧皮質醇和11-脫氧皮質醇。21-OHD的臨床表現由基因突變所致的殘余酶的活性決定，包括經典型和非經典型(NC)，前者又根據有無失鹽表現分為失鹽型(SW)和單純男性化型(SV)。失鹽型、單純男性化型和非經典型在本質上定性劃分，但在出生時沒有高雄激素血癥表現的男性中鑒別SV和NC是很困難的，必須借助于基因型檢測，對于其他難以判斷的病例也要依靠基因診斷?；驒z測分析，不僅可以對疾病進行早期診斷，并且可以對患者的基因類型進行鑒別，是一種基于病因檢測的確診手段，對臨床具有重要的診斷價值。

目前用于檢測21-OHD的方法有直接測序法，多重連接依賴性探針擴增技術和位點特異性PCR-限制性酶切分析等，這些方法不同程度的存在低通量、技術操作復雜，標本易污染和成本高的缺點，不易推廣到臨床大規模應用。熒光偏振檢測技術是一種熒光標記檢測技術，利用熒光標記的探針與目的片段的擴增產物進行雜交，用熒光偏振儀檢測FP值，陽性對照發生擴增反應，熒光標記探針與擴增產物中待測靶基因單鏈分子同源互補雜交，FP值會隨熒光標記分子的相對分子質量增加而增加，反之陰性對照品與熒光探針分子未發生同源雜交，熒光標記分子的相對分子質量保持不變，FP值較陽性對照低[4]。FP法不需分離游離和結合的示蹤物，而且所有測定均在溶液中進行，結果判斷僅需數字比較，不需高精度的實時熒光強度檢測設備與圖像分析，FP值的大小與熒光強度無關，易實現標準化和自動化，因而具有快速、簡單和準確靈敏等特點[5]。本方法已廣泛用于包括單核苷酸多態性(SNPs)和單倍型在內的基因變異研究[6]。

本研究共收集到2例患者，通過本體系檢測，男性患兒基因突變類型為G56R/ 920-921insT雜合突變，女性患兒基因突變分析提示為I172N/Q318X雜合突變。上述4種基因突變中，920-921insT和Q318X為酶活性完全喪失的突變。G56R是一種罕見的突變，保有正常酶活性的0.7%～1.4%，表現為單純男性化型[7]。I172N為中等程度的突變，保有正常酶活性2%，為單純男性化型中最常見的類型。21-OHD中，95%是由于基因間重組所致，僅有5%為自發突變[8]。本研究中該女性患兒I172N為自發突變，其父母均未檢測到攜帶此致病突變。

本研究中建立了一種基于熒光偏振的檢測體系，同時聯合直接測序法，對于中國人群常見的10種21-OHD進行檢測，熒光偏振檢測技術與直接測序法相比，兩者沒有明顯差別，符合率高達100%。熒光偏振檢測技術是一種簡單、敏感和特異的檢測方法，其高通量及低廉的價格給試驗帶來諸多方便。先天性腎上腺皮質增生癥的臨床表現缺乏特異性，在新生兒時期易與幽門狹窄，食道閉鎖等疾病混淆，嬰幼兒時期易與性早熟，引起兩性畸形的其他疾病相混淆，經典型CAH嚴重者可出現腎上腺危象、休克等嚴重危害生命的并發癥，為防止并發癥的產生，降低病死率，早期診斷及合理治療至關重要?；蛟\斷對于21-OHD患者的遺傳咨詢和產前診斷是唯一可靠的方法，本研究旨在建立一種簡便、價廉、準確，可廣泛應用于臨床的21-OHD檢測手段，熒光偏振檢測聯合直接測序法為21-OHD的診斷提供了新思路。

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Establishment and application of a method for gene diagnosis of 21-hydroxylase deficiency

ZHANGLi，JIAOKai△,ZHANGJu

(DepartmantofEndocrinology,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710038,China)

Objective To establish a new method for detecting 21-hydroxylase deficiency in congenital adrenal hyperplasia(CAH) by using the fluorescence polarization technology combined with direct sequencing,and to detect 2 most common gene deletions and 8 point mutations of CYP21A2 gene in Chinese population.Methods The peripheral blood samples in 40 normal people and 2 patients were collected and genomic DNA were extracted.To detect the gene deletion of CYP21A2,at first,universal primers were designed to amplifly CYP21A2 and CYP21A1P allele fragments,and then the specific TAMRA fluorescence labeled probe was used to hybrid with amplification products,at last,the fluorescence polarization instrument was adopted to test FP value for determining whether the gene deletion was happened.The sequence GAGACTAC was designed on the primer which was specific to CYP21A2 to detect the Exon3 Del 8 bp(GAGACTAC) deletion.To detect point mutations,5 pairs highly specific primers for CYP21A2 gene were designed according to the sequence differences between CYP21A2 and its pseudogene.The whole CYP21A2 gene was amplified and sequenced to detect the most common type of 8 kinds of point mutations in Chinese people,including P30L,i2g,I172N,E6Cluster,V281L,920-921insT,Q218X and R356W.Results CYP21A2 gene deletion was not detected by the fluorescence polarization method,the results had no statistical differences compared with the direct sequencing method,the consistency rate reached up to 100%.No point mutation of CYP21A2 gene was found in the 40 healthy people.The two patients,one case was detected with Exon1 G56R,Exon7 c.920-921 insert T heterozygous mutations,another patient carried Exon4 I172N,Exon8 Q318X heterozygous mutations.Conclusion The fluorescence polarization method combined with direct sequencing in the diagnosis of 21-OHD is an effective way,which can be widely used in clinic,not only can analyze the type of gene mutation,but also can play an important role in genetic counseling and prenatal diagnosis.

congenital adrenal hyperplasia(CAH); 21-hydroxylase deficiency; fluorescence polarization; CYP21A2 gene

張麗，女，在讀碩士，主要從事先天性腎上腺皮質增生癥基因診斷方面的研究。△

,E-mail:1845370877@qq.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.17.025

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1672-9455(2015)17-2545-03

2015-04-16

2015-05-15)