液相基因芯片技術在崇明地區人乳頭瘤病毒檢測和分型中的應用*

張 莉，冷 俊，周 曄，張 蕾，楊惠萍，陳 峰

(上海交通大學醫學院附屬新華醫院崇明分院:1.檢驗科;2.婦科;3.病理科 202150)

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·論 著·

液相基因芯片技術在崇明地區人乳頭瘤病毒檢測和分型中的應用*

張 莉1，冷 俊1，周 曄1，張 蕾2，楊惠萍2，陳 峰3

(上海交通大學醫學院附屬新華醫院崇明分院:1.檢驗科;2.婦科;3.病理科 202150)

目的 探究液相基因芯片技術在崇明地區人乳頭瘤病毒(HPV)檢測和分型中的應用。方法 選取2011年5月至2013年4月該院婦科門診就診者宮頸脫落細胞500例，使用液相基因芯片技術對其進行HPV基因型檢測。并對80例患者進行病理診斷，根據組織病理學將80例患者分為炎性反應組、細胞學正常組、宮頸癌組、宮頸上皮內瘤變(CIN)Ⅰ組、CINⅡ組、CINⅠ～Ⅱ組、CINⅢ組。將病理診斷結果和HPV DNA亞型分布結果結合分析，對崇明地區宮頸病變程度和HPV感染基因型的關系進行分析。結果 500例標本中共180例HPV陽性患者，HPV總感染率為36%，共檢出22種基因型，按照感染率從高到低依次為HPV-16、HPV-52、HPV-58、HPV-18、HPV-11、HPV-6、HPV-31。其中高危型感染為85.96%，低危型感染為14.04%。500例標本中共180例HPV陽性患者，其中44例(24.44%)患者年齡為21～25歲的女性，11例(6.15%)患者年齡為51～67歲的女性，隨著年齡的增大HPV陽性例數減少。隨著宮頸病變級別的升高HPV感染率逐漸升高，兩兩比較結果顯示，炎性反應組與正常組、CINⅢ組與CINⅡ組、宮頸癌組與CINⅡ組、宮頸癌組與CINⅢ組之間差異無統計學意義(P>0.05)；其余11對兩兩對比差異具有統計學意義(P<0.05)。隨著宮頸病變級別的升高HPV多重感染率逐漸升高，但是僅炎性反應組與CINⅢ、CINⅡ組間差異有統計學意義(P<0.05)。將組織病理學作為確診標準，液相芯片HPV DNA檢測CINⅢ、CINⅡ的特異度為76.63%，靈敏度為88.57%，陰性預測值為92.16%，陽性預測值為68.89%。結論 崇明地區常見的HPV感染基因型為HPV-16、HPV-52、HPV-58、HPV-18、HPV-11、HPV-6、HPV-31。HPV陽性多發于年輕女性，且HPV多重感染和感染率均隨著宮頸病變的程度加重而加重。因而液相芯片HPV DNA檢查對大規模篩查和宮頸病變的臨床診斷有十分重要的價值。

液相基因芯片技術； 人乳頭瘤病毒； 檢測； 分型

人乳頭瘤病毒(HPV)是引起宮頸癌的主要因素，具有較多的亞型，臨床上已經明確其有40多種亞型感染在人下生殖道中，且根據亞型的致病能力將其分為低危型和高危型兩種類型[1]。臨床上常用來篩查宮頸癌的重要手段為HPV檢測，且基因芯片技術能夠與分型同時進行，是用于HPV基因型研究的主要技術[2]。液相基因芯片技術是優于固相芯片技術將Luminex XMAP作為基礎系統的新技術，采用96孔板操作，能夠1次將26種亞型全部呈現出來[3]。因此本文選取2011年5月至2013年4月本婦科門診就診者宮頸脫落細胞500例，使用液相基因芯片技術對其進行HPV基因型檢測。對液相基因芯片技術在崇明地區人乳頭瘤病毒檢測和分型中的應用進行了探究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年5月至2013年4月本院婦科門診就診者宮頸脫落細胞500例，年齡17～67歲，平均(33.6±8.4)歲。并將80例患者按照5歲1個年齡段分為8個年齡組。同時給予80例患者病理診斷，將其分為炎性反應組(33例)、細胞學正常組(23例)、宮頸癌組(1例)、CINⅠ組(10例)、CINⅡ組(6例)、CINⅠ～Ⅱ組(1例)、CINⅢ組(6例)。

1.2 方法

1.2.1 材料 生物素標志β-globin引物PCR、生物素標志MY09-MY11通用物PCR、宮頸脫落細胞DNA抽提試劑盒、熒光標志SA-PE、Luminex懸浮微球雜交探針，上述均為上海透景生命科技有限公司生產；Luminex 100多功能流式點陣分析儀(美國Luminex公司生產)；Master Cycler Gradient PCR擴增儀(德國Eppendorf公司生產)。

1.2.2 采集標本 根據宮頸脫落細胞取樣的要求和步驟采取宮頸細胞，并將標本保存在有細胞保存液的小瓶中，放置在4 ℃的環境中保存等待檢測。

1.2.3 HPV分型檢測 提取宮頸脫落細胞HPV DNA，進行HPV PCR擴增，液體雜交，進行Luminex 100 HPV分型，并將結果記錄下來。操作步驟和結果的判讀嚴格按照試劑盒的要求進行。

1.3 統計學處理 應用SPSS19.0軟件對數據結果進行統計學分析，計數資料以頻數表示，比較采用χ2檢驗。各組間進行兩兩比較，以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 崇明地區高危人群HPV基因型分布 研究結果顯示，500例標本中共180例HPV陽性患者，HPV總感染率為36%，共檢出22種基因型，按照感染率從高到低依次為HPV-16、HPV-52、HPV-58、HPV-18、HPV-11、HPV-6、HPV-31。其中高危型感染為85.96%，低危型感染為14.04%。見表1。

2.2 不同年齡組HPV陽性患者在所有HPV陽性患者中的構成比 研究結果顯示，500例標本中共180例HPV陽性患者，其中44例(24.44%)患者年齡為21～25歲的女性，11例(6.15%)患者年齡為51～67歲的女性，隨著年齡的增大HPV陽性例數減少。見表2。

表1 崇明地區高危人群HPV基因型分布

注：單一型感染80例，混合型感染76例，HPV各基因型陽性共有256例。

表2 不同年齡組HPV陽性患者在所有HPV陽性

2.3 各病理組HPV單一型、多重感染陽性率及總感染率 研究結果顯示，隨著宮頸病變級別的升高HPV感染率逐漸升高，兩兩比較結果顯示，炎性反應組與正常組、CINⅢ組與CINⅡ組、宮頸癌組與CINⅡ組、宮頸癌組與CINⅢ組之間差異無統計學意義(P>0.05)；其余11對兩兩對比差異具有統計意義(P<0.05)。隨著宮頸病變級別的升高HPV多重感染率逐漸升高，但是僅炎性反應組與CINⅢ、CINⅡ組間差異有統計學意義(P<0.05)。將組織病理學作為確診標準，液相芯片HPV DNA檢測CINⅢ、CINⅡ的特異度為76.63%，靈敏度為88.57%，陰性預測值為92.16%，陽性預測值為68.89%。見表3。

表3 各病理組HPV單一型、多重感染陽性率及總感染率

3 討 論

人乳頭瘤病毒是一種相對分子質量較小的DNA雙鏈病毒，有較強的宿主和組織特異性，強烈的噬上皮性，會導致人類的黏膜和皮膚增生異常，進而引起多種惡性和良性的病變[4]。HPV病毒具有較長的感染潛伏期，多見于亞臨床感染，因而需要對HPV感染進行準確的早期診斷，預防癌變。液相基因芯片技術是一種將5.6 μm的聚苯乙烯微球作為熒光染料進行染色的生物芯片，操作較方便，因而被廣泛應用[5]。因此本文選取2011年5月至2013年4月本院婦科門診就診者宮頸脫落細胞500例，使用液相基因芯片技術對其進行HPV基因型檢測。對液相基因芯片技術在崇明地區人乳頭瘤病毒檢測和分型中的應用進行了探究。

本文研究結果顯示，500例標本中共180例HPV陽性患者，HPV總感染率為36%，共檢出22種基因型，按照感染率從高到低依次為HPV-16、HPV-52、HPV-58、HPV-18、HPV-11、HPV-6、HPV-31。其中高危型感染為85.96%，低危型感染為14.04%。這與以往的研究結果不同，這說明了HPV型特異性感染率會受到社會經濟、人群、文化、地域等因素的影響[6]。500例標本中共180例HPV陽性患者，其中44例(24.44%)患者年齡為21～25歲的女性，11例(6.15%)患者年齡為51～67歲的女性，隨著年齡的增大HPV陽性例數減少。隨著宮頸病變級別的升高HPV感染率逐漸升高，兩兩比較結果顯示，炎性反應組與正常組、CINⅢ組與CINⅡ組、宮頸癌組與CINⅡ組、宮頸癌組與CINⅢ組之間差異無統計學意義(P>0.05)；其余11對兩兩對比差異具有統計意義(P<0.05)。隨著宮頸病變級別的升高HPV多重感染率逐漸升高，但是僅炎性反應組與CINⅢ、CINⅡ組間差異有統計學意義(P<0.05)。這可能是由于本文所采納的研究對象過少所致。將組織病理學作為確診標準，液相芯片HPV DNA檢測CINⅢ、CINⅡ的特異度為76.63%，靈敏度為88.57%，陰性預測值為92.16%，陽性預測值為68.89%。這說明HPV感染的分型和早期診斷是處理宮頸病變的重要方法。而本文所使用的液相基因芯片技術具有以下幾個特點：(1)較高的靈敏度：每一個微球上都能夠以共價鍵結合的方式將多個抗體、抗原和核酸包被，同時由于探針具有較高的密度，能夠產生較強的信號，加上使用熒光檢測具有較高的敏感性，因而液相基因芯片技術具有較高的靈敏度[7]。(2)較高的通量：液相基因芯片技術能夠在同一時間對同一個標本中多種不同的目的分子進行定量和定性的分析，因而具有較高的通量[8]。(3)較快的反應速度：由于液相基因芯片技術中的雜交過程是在懸浮的液相中進行的，因而其所需要的反應時間較短，同時雜交后可以直接讀數不需要進行清洗，能夠節省大量的時間，具有較快的反應速度[9]。(4)較高的靈活性：液相基因芯片技術能夠用于對各種核酸和蛋白質的分析，并且可以根據不同的待測項目進行自由組合[10]。(5)操作簡單。

綜上所述，崇明地區常見的HPV感染基因型為HPV-16、HPV-52、HPV-58、HPV-18、HPV-11、HPV-6、HPV-31。HPV陽性多發于年輕女性，且HPV多重感染和感染率均隨著宮頸病變的程度加重而加重。因而,液相芯片HPV DNA檢查對大規模篩查和宮頸病變的臨床診斷有十分重要的價值。

[1]Groner JA,Harris GD,Harper DM,et al.Reduction in HPV prevalence-no evidence to support HPV vaccination reduces HPV prevalence[J].J Infect Dis,2014,209(8):1302-1304.

[2]梁惠萍,邱麗容.高危型人乳頭瘤病毒檢測對宮頸病變的診斷價值[J].中國醫藥導報,2012,9(34):48-49.

[3]樓玲芳.液基薄層細胞學檢測和高危型人乳頭狀瘤病毒檢測在宮頸癌及癌前病變篩查和預后判斷中的應用價值[J].中國醫師進修雜志,2013,36(15):41-43.

[4]SmithBC.Comparisonofcervicalcancerscreeningstrategiesincorporatingdifferentcombinationsofcytology,HPVtesting,andgenotypingforHPV16/18:results from the ATHENA HPV study[J].Am J Obstet Gynecol,2013,208(3):184-186.

[5]王清,丁顯平,李天俊,等.液相芯片快速檢測結核耐藥基因方法建立[J].四川大學學報:自然科學版,2012,49(6):1364-1368.

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Application of liquid gene chip technology in human papillomavirus detection and typing in Chongming area*

ZHANGLi1,LENGJun1,ZHOUYe1,ZHANGLei2,YANGHui-ping2,CHENFeng3

(1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.DepartmentofGynecology;3.DepartmentofPathology,ChongmingBranchHospitalofXinhuaHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai202150,China)

Objective To explore the application of the liquid gene chip technology in the human papillomavirus (HPV) detection and genotyping in Chongming area.Methods 500 cases of cervical exfoliated cells in the gynecology outpatient department of our hospital from May 2011 to April 2013 were selected and performed the HPV genotyping by using the liquid gene chip technology.80 cases were performed the pathological diagnosis and divided into the groups of inflammation reaction,normal cytology,cervical cancer,cervical intraepithelial neoplasia(CIN)Ⅰ,CINⅡ,CINⅠ-Ⅱand CINⅢ according to the histopathology.The pathological diagnosis results and subtype distribution results of HPV DNA were combined to conduct the analysis.The relationship between the degree of cervical lesions and HPV infection genotypes in Chongming area was analyzed.Results Among 500 specimens,180 cases were HPV-positive,the HPV total infection rate was 36%,22 genotypes were detected,according to the descending order which were in turn HPV-16,HPV-52,HPV-58,HPV-18,HPV-11,HPV-6 and HPV-31.Among them,the high risk infection accounted for 85.96% and low-risk infection for 14.04%.Among 500 cases of samples,180 cases were HPV-positive patients,including 44 patients(24.44%) aged 21-25 years old,11 cases(6.15%) patients aged 51-67 years old,with age increasing,number of HPV-positive cases was decreased.With the increase of cervical lesions severity,the HPV infection rate was increased,the pairwise comparison showed that the differences between the inflammatory group and the normal group,between CINⅢ and CINⅡ,between cancer group and CINⅡ group,between cervical cancer group and the CINⅢ group was not statistically significant (P>0.05);the differences of pairwise comparison in remaining 11 pairs had statistically significant difference(P<0.05).With the increase of cervical lesions,the multiple HPV infection rate was gradually increased,but only the differences between the inflammation group with the CINⅢ,CINⅡ groups were statistically significant(P<0.05).With the histopathology as the diagnostic standard,in testing CINⅢ and CINⅡ by the liquid chip HPV DNA, the specificity was 76.63%,the sensitivity was 88.57%,negative predictive value was 92.16% and the positive predictive value was 68.89%.Conclusion Common genotypes of HPV infection in Chongming area are HPV-16,HPV-52,HPV-58,HPV-18,HPV-11,HPV-6 and HPV-31.The HPV-positive is more common in young women,and the HPV multiple infection and infection rate are aggravated with the aggravation of cervical lesion severity.Thus the liquid chip HPV DNA examination has a very important value for large-scale screening and clinical diagnosis of cervical lesions.

liquid gene chip technology; human papillomavirus; testing; typing

上海市崇明縣科學技術發展資金資助項目(CK2011-28)。

張莉，女，本科，主任技師，主要從事臨床免疫學研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.17.026

A

1672-9455(2015)17-2548-03

2015-02-19

2015-05-29)