脂聯素及其基因多態性與某地冠心病的相關性研究

劉運端(廣西壯族自治區玉林市紅十字會醫院檢驗科 537000)

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脂聯素及其基因多態性與某地冠心病的相關性研究

劉運端(廣西壯族自治區玉林市紅十字會醫院檢驗科 537000)

目的 探討某地瑤族冠心病(CHD)患者血清脂聯素(APN)水平及其基因位點+45 T/G和-11377 C/G的多態性與該地區瑤族健康者、漢族CHD患者、漢族健康者的差異。方法 采用酶聯免疫吸附(ELISA)方法檢測瑤族CHD患者、瑤族健康者、漢族CHD患者和漢族健康者(各100例)血清APN水平；使用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)技術檢測 APN 基因位點+45T/G和-11377C/G的多態性。結果 (1)2組CHD患者血清APN水平明顯低于2組健康對照者，差異有統計學意義(均P<0.05)。2組CHD患者血清APN水平差異無統計學意義(P=0.076)。(2)在H-W平衡檢驗中,4組研究對象APN基因位點+45T/G和-11377C/G均有群體代表性(均P>0.05)。(3)瑤族CHD患者ANP+45TG、GG基因型頻率均高于瑤族健康者，但差異無統計學意義(P>0.05)；漢族CHD患者ANP+45 基因型等位基因頻率略高于瑤族CHD患者，但差異無統計學意義(P>0.05)。(4)CHD患者ANP-11377 基因型和等位基因頻率與同民族健康者比較，差異有統計學意義(P<0.05)；瑤族CHD患者APN-11377基因雜合程度略低于漢族CHD患者，但差異無統計學意義(P>0.05)。結論 血清低APN水平和APN-11377位點是瑤族CHD患者的危險因素，與漢族CHD患者相同。

脂聯素； 基因多態性； 瑤族； 冠心病

冠心病(CHD)是由冠狀動脈發生動脈粥樣硬化病變而引起血管狹窄、供血不足，心肌缺血、缺氧而導致的心臟病，是致死致殘率較高的疾病之一。目前，我國CHD發病率有升高、發病年齡有提前的趨勢。CHD是由遺傳因素、環境因素和不良生活習慣相互作用導致的復雜疾病，其中易感基因可能對CHD的發生起非常重要的作用。脂聯素(APN)是由脂肪細胞特異性分泌的活性因子，具有抗炎性、抗動脈粥樣硬化、抗血小板聚集等生物作用。近年來研究發現APN 所在基因區域與心血管疾病相關，且基因多態性具有地區、種族的特異性。本研究旨在通過檢測廣西瑤族CHD患者APN 水平及其基因位點+45 T/G和-11377C/G 基因多態型及等位基因的分布頻率，探討APN水平及2個基因位點與廣西瑤族CHD的關系，從而為臨床治療提供實驗室數據。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 瑤族CHD患者、瑤族健康者、漢族CHD患者和漢族健康者，各100例。瑤族CHD患者(瑤族CHD組)：男53例，女47例，年齡49～75歲，平均年齡58.3歲。瑤族健康者(瑤族健康對照組)：男52例，女48例，年齡44～71歲，平均年齡56.9歲。漢族CHD患者(漢族CHD組)：男55例，女45例，年齡46～78歲，平均年齡57.5歲。漢族健康者(漢族健康對照組)：男54例，女46例，年齡47～69歲，平均年齡58.1歲。瑤族入選標準：(1)居住在廣西瑤族主要分布區的瑤族個體。(2)3代中未有與外族通婚的瑤族家族，選擇第3代個體為研究對象，且盡可能確保研究對象在其可追蹤的歷史上沒有與外族通婚。(3)無遺傳性疾病家族史及其他急、慢性疾病史。CHD診斷標準[1]：選擇冠狀動脈造影顯示左主干狹窄大于或等于30%或其他3支至少有1支冠狀動脈狹窄大于或等于50%者。瑤族CHD患者須符合上述2個入選標準，且動態心電圖ST段下移。4組研究對象的年齡、性別等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。采樣過程遵循知情同意原則，通過詢問確保樣本間無血緣關系。

1.2 標本采集 抽取所有研究對象的靜脈血4 mL，分別注入干燥管和 EDTA抗凝管中，并充分混勻。30 min后，干燥管3 000 r/min,離心10 min，分離血清-20 ℃冰箱保存，采用酶聯免疫吸附(ELISA)方法檢測血清APN水平，嚴格按照試劑說明書操作。EDTA管用于APN基因位點多態性檢測。

1.3 儀器與試劑 9700擴增儀(美國ABI公司);RT-6000酶標儀(深圳雷杜生命科學有限公司)；電泳儀(北京六一儀器廠);凝膠成像儀(珠海黑馬生物公司)。APN試劑(美國GBD公司提供)；DNA 抽提試劑(深圳益生堂生物有限公司)。

1.4 DNA制備 采用離心柱法，嚴格按照試劑說明書進行，最后將DNA 溶于TE 緩沖液，-20 ℃保存備用。

1.5 APN基因檢測 (1)反應體系：在50 μL總體積中進行，每孔反應體系內含8 μL PCR混合反應液(含d NTP、buffer)、Taq酶0.5 μL、無菌水37.5 μL、上下游引物各1 μL、DNA模版2 μL，充分混勻。(2)APN基因位點+45 擴增條件和限制性片段長度多態性：94 ℃ 5 min預變性；94 ℃ 1 min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環,最后72 ℃延伸7 min。取PCR后產物20 μL、BspHI 內切酶1 μL，buffer 3 μL，無菌水6 μL，37 ℃ 環境酶切1 h。APN+45 (T/G) PCR產物為745 bp，酶切后為291 bp 和454 bp的2個片段(G等位基因)。在2%瓊脂糖凝膠上點樣，電壓100 V，電泳60 min后自動凝膠圖像分析儀觀察電泳結果并攝像保存。(3)APN基因位點-11377 擴增條件和限制性片段長度多態性：94 ℃ 5 min預變性；94 ℃ 1 min，62 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環,最后72 ℃延伸5 min。取PCR產物20 μL、AlwNI 內切酶1 μL，buffer 3 μL，無菌水6 μL，37 ℃ 酶切1 h。SNP-11377C/G的PCR產物長度為450 bp(C等位基因),酶切后為95 bp和355 bp(G等位基因)2個片段。在2%瓊脂糖凝膠上點樣，電壓100 V，電泳30 min后自動凝膠圖像分析儀觀察電泳結果并攝像保存。見表1。

表1 APN+45和-11377基因位點引物序列

1.6 統計學處理 采用統計軟件SPSS 16.0進行數據處理，同民族間和CHD組間的APN水平比較使用t檢驗；APN等位基因進行Hardy-Weinberg(H-W)平衡檢驗；4組間APN基因頻率分布的差異，采用卡方檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 4組研究對象血清APN水平結果比較 瑤族CHD組患者血清APN水平明顯低于瑤族健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。漢族CHD組患者APN水平也顯著低于漢族健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。瑤族CHD組患者血清APN水平略高于漢族CHD組患者，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 4組研究對象血清APN水平結果比較

注：與同民族健康對照組比較，*P<0.05;△P<0.05。

2.2 4組APN基因分型結果比較 野生型是2組健康對照者APN+45和-11377位點的主要型別，APN+45和-11377基因位點雜合程度最高的是漢族CHD組患者。經H-W平衡檢驗,比較觀察值和期望值,4組APN 2個位點均無統計學意義(P>0.05),符合H-W 群體遺傳平衡法則，具有群體代表性。見表3。

2.3 4組研究對象APN+45基因多態性的結果比較 使用卡方檢驗比較4組研究對象APN+45等位基因頻率,提示漢族CHD組TG和GG基因頻率明顯高于漢族健康對照組，差異有統計學意義(χ2=8.122，P=0.017)；瑤族CHD組TG和GG基因頻率明顯高于瑤族健康對照組，但差異無統計學意義(χ2=5.121；P=0.077)；瑤族CHD組APN+45基因雜合程度也略低于漢族CHD組，但差異無統計學意義(χ2=1.750；P=0.417)。見圖1。

注：M:marker；1、2：TT型；3：TG型；4：GG型。

圖1 APN基因+45位點T/G 擴增產物酶切電泳圖

2.4 4組APN-11377基因多態性的比較 4組研究對象APN-11377基因多態性分布顯示，2組CHD患者的等位基因頻率明顯高于2組健康對照者，差異有統計學意義(χ2=12.522，P=0.002；χ2=17.275；P=0.000)；瑤族CHD組患者APN-11377基因雜合程度也略低于漢族CHD組，但差異無統計學意義(χ2=0.363，P=0.834)。見圖2。

注：M:marker;1：CG型；2、3：CC型；4、5：GG型。

3 討 論

APN是近年來發現的一種具有抗炎性、抗動脈粥樣硬化、抗血小板聚集、由脂肪組織特異性分泌的活性因子。可通過自分泌、旁分泌和內分泌方式影響葡萄糖轉化、脂質代謝、血管內皮功能、炎性反應和胰島素抵抗。APN對動脈粥樣硬化的保護作用機制可能為:(1)抑制巨噬細胞轉化為泡沫細胞[2]。(2)通過環磷酸腺苷/蛋白激酶A途徑發揮抑制內皮細胞的炎性反應[3]。(3)抑制血管平滑肌細胞增殖[4]。(4)促進肝臟合成高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)而發揮膽固醇逆轉運功能、抗氧化功能和抗炎性等作用[5]。(5)通過對血管舒張因子一氧化氮(NO)增強血管舒張、抑制血小板聚集、單核細胞黏附以及血管平滑肌細胞增殖等作用，從而對血管系統起保護作用[6]。李長江等[7]研究表明,APN通過抑制血管壁黏附分子的表達，達到抗動脈粥樣硬化的目的。APN還通過上調泡沫細胞三磷酸腺苷結合盒轉運體A1表達，促進泡沫細胞內膽固醇的外流，分解發揮其抗動脈粥樣硬化的作用[8]。APN基因位于人染色體3q27區域，該區域包括3個外顯子和2個內含子，具有豐富的多態性，也是2型糖尿病、代謝綜合征、CHD的易感基因區域[9-12]。但APN基因SNP 在不同種族、地區分布差異較大,以致于國內外研究結果不一致,甚至對同一種族不同地區人群的研究也會有不同結果[13]。

本研究結果表明，與瑤族健康對照組比較，瑤族CHD組和漢族CHD組血清APN水平顯著降低，這與Kizer等[14]和徐麗等[15]的研究結果相似，證實血清低APN水平可能是CHD的危險因素。瑤族CHD組APN水平略高于漢族CHD組，這可能跟瑤族CHD組體質量指數略低于漢族CHD組相關。APN+45基因比較，瑤族CHD組和漢族CHD組APN+45的T/G、G/G基因型明顯高于瑤族健康對照組，雖然瑤族CHD組與瑤族健康對照組差異無統計學意義(P>0.05)，原因可能與實驗例數較少有關。等位基因頻率顯示G等位基因在廣西地區CHD患者中較多見，提示攜帶SNP+45G基因型更易發展為CHD，是CHD的一個危險因素，與國內外研究相似[9，14]。對APN-11377基因進行比較，瑤族CHD組和漢族CHD組APN-11377基因雜合程度明顯區別于瑤族健康對照組，提示APN-11377 基因多態性與CHD相關，也是CHD的一個危險因素。2組CHD患者比較差異無統計學意義(P>0.05)，提示APN-11377是該地區瑤族和漢族CHD的易感基因。

綜上所述，血清低APN水平和APN-11377基因位點是廣西地區漢族、瑤族CHD患者的易感因素。APN+45基因位點是否是瑤族CHD的易感基因，還需增加樣本量作進一步研究。

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Study on relations between adiponectin and its gene polymorphism and Yao coronary heart disease of Guangxi district

LIUYun-duan

(DepartmentofLaboratory,YulinRedCrossHospitalinGuangxiDistrict，Yulin,Guangxi537000，China)

Objective To investigate the difference of serum levels of adiponectin and its gene polymorphism in Yao patients with CHD of Guanxi district and Han CHD patients and Yao normal people in same region．Methods The levels of serum adiponectin in Yao CHD patients,Han CHD patients,Yao normal people and Han normal people(each of 100 cases)were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method,and APN+45 and APN-11377 genotyping were conducted by using PCR-RFLP.Results The levels of adiponectin in two groups of CHD patients were significantly lower than same race normal group,the difference were statically significant (P=0.000；P=0.000).The adiponectin levels of two CHD groups was not statically significant difference (P=0.067);(2) The APN+45 and APN-11377 of four groups conform the Hardy-Weinberg population genetic equilibrium law (allP>0.05);(3)The TG and GG genotype frequency of APN+45 In two CHD groups were higher than same race normal group,but the difference of Yao CHD group and Yao normal group was no statically significant(χ2=8.122，P=0.017;χ2=5.121；P=0.077),and the difference of Yao CHD group and Han CHD group were not statically significant(χ2=1.750；P=0.417);(4) The CG and GG genotype frequency of APN-11377 in two CHD groups were higher than same race normal group,the difference of Yao CHD group and Yao normal group was statically significant(χ2=12.522，P=0.002；χ2=17.275；P=0.000),and the difference of Yao CHD group and Han CHD group were not statically significant(χ2=0.363；P=0.834).Conclusion As with Han CHD patients,serum low APN level and APN-11377 loci may be risk factors of Yao CHD patients.

adiponectin; polymorphism; Yao nationality; coronary heart disease

劉運端，男，本科，主管檢驗師，主要從事臨床檢驗研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.11.029

A

1672-9455(2015)11-1567-03

2014-12-20

2015-02-10)