新型心肌梗死大鼠模型制備方法的建立和模型鑒定*

裴之俊，李伏燕，陳義加，王俊杰，李 薇，吳瑞敏，楊 怡

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院PET中心，湖北十堰 442000)

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·論 著·

新型心肌梗死大鼠模型制備方法的建立和模型鑒定*

裴之俊，李伏燕，陳義加，王俊杰，李 薇，吳瑞敏，楊 怡

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院PET中心，湖北十堰 442000)

目的 建立可用于制備心肌梗死大鼠模型的新方法。方法 異氟醚氣體麻醉Sprague-Dawley大鼠后，鈍性分離肋間肌，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，制備心肌梗死大鼠模型。以僅穿刺不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支的方法制備假手術(shù)大鼠模型。術(shù)后采用小動(dòng)物心電圖儀、血流動(dòng)力學(xué)分析儀、2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色及蘇木素-伊紅(HE)染色鑒定心肌梗死大鼠模型。結(jié)果 心肌梗死大鼠模型及假手術(shù)大鼠模型存活率均為80.0%。心肌梗死模型組大鼠術(shù)后第2、7天心電圖檢查可見(jiàn)ST段明顯抬高。血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，心肌梗死模型組大鼠頸總動(dòng)脈收縮壓和舒張壓，左心室收縮壓，以及左心室壓力上升和下降最大速率均較假手術(shù)模型組均明顯降低，心率和左心室舒張末壓則明顯增加(P<0.05)。TTC染色顯示梗死心肌與正常心肌色差明顯，壞死心肌呈白色。HE染色顯示梗死心肌細(xì)胞腫脹、排列紊亂，出現(xiàn)空泡，甚至斷裂，部分?jǐn)嗔研募〖?xì)胞間隙見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)論 建立的方法效果理想且操作簡(jiǎn)單，適用于心肌梗死大鼠模型的制備。

心肌梗死； 動(dòng)物模型； 大鼠； 冠狀動(dòng)脈

隨著人們生活習(xí)慣的改變及膽固醇攝入量的增加，缺血性心血管疾病發(fā)病率逐年增加。由于臨床研究難以對(duì)缺血性心血管疾病的病理、生理改變進(jìn)行分析，因此需要開(kāi)展大量的基礎(chǔ)研究[1]。此外，可用于缺血性心血管疾病治療的各種新方法，如激光心肌血管重建、細(xì)胞移植再生治療、基因治療等，也需要通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析其安全性、療效、作用機(jī)制等[2]。因此，心血管疾病動(dòng)物模型不但可以用于心缺血性心血管疾病發(fā)病機(jī)制及預(yù)防的基礎(chǔ)研究，同時(shí)也是研究新型治療方法的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的心肌梗死動(dòng)物模型制備方法，例如Johns法，主要采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法，已得以廣泛應(yīng)用，但仍然存在耗時(shí)長(zhǎng)、操作步驟繁瑣、動(dòng)物存活率低等弊端[3-4]。本研究對(duì)傳統(tǒng)的Johns法進(jìn)行了改進(jìn)，并以改進(jìn)后的方法制備Sprague-Dawley(SD)大鼠心肌梗死模型。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)成年雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量(221.5±23.4)g，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將30只SD大鼠隨機(jī)分為心肌梗死模型組(20只)和假手術(shù)模型組(10只)。

1.2 儀器與試劑 BL2420E型生物信號(hào)采集與處理系統(tǒng)購(gòu)自成都泰盟科技有限公司，ECGenie型小動(dòng)物心電圖機(jī)購(gòu)自美國(guó)Mouse Specifics公司。異氟醚、蘇木素-伊紅(HE)染色劑、2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，中性樹(shù)膠購(gòu)自中藥化學(xué)試劑公司，Hochest33342購(gòu)自浙江杭州碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型制備 心肌梗死動(dòng)物模型的制備主要采用Johns法，同時(shí)參考Fisbein等[5]、Pfeffer等[6]和Tarnavski等[7]提出的制備方法。心肌梗死模型組制備方法：采用小動(dòng)物氣體麻醉箱對(duì)SD大鼠進(jìn)行異氟醚預(yù)麻醉，完全麻醉后接氣體麻醉呼吸面罩，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)；胸前皮膚去毛、消毒，順肋間隙方向于胸骨左旁第3～4肋間切開(kāi)皮膚，切口長(zhǎng)約2 cm，同時(shí)切開(kāi)深、淺筋膜，鈍性分離胸大肌和前鋸肌，顯露肋骨，充分止血后，由第4肋間入胸，鈍性分離肋間肌，用止血鉗輕輕分離心包膜，迅速開(kāi)胸?cái)D出心臟，用5-0無(wú)創(chuàng)縫合針結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，迅速歸回心臟；撤去氣體麻醉面罩，用止血鉗夾住胸前創(chuàng)口，進(jìn)行心臟按壓直至大鼠恢復(fù)自主呼吸；逐層縫合胸壁。假手術(shù)模型組制備方法：用5-0無(wú)創(chuàng)縫合針穿行大鼠肺動(dòng)脈圓錐與左心耳下緣交界的左冠狀動(dòng)脈前降支，不打結(jié)；其余操作過(guò)程與心肌梗死模型組相同。采用小動(dòng)物心電圖儀于術(shù)后第2、7天行三導(dǎo)聯(lián)心電圖檢測(cè)。

1.3.2 術(shù)后處理 術(shù)后向大鼠腹腔內(nèi)注射50萬(wàn)單位青霉素用于預(yù)防感染；采用臺(tái)燈照射的方法進(jìn)行保溫，保溫時(shí)間6 h。術(shù)后給予大鼠正常飲食，清潔飲水，飲水每天更換，飼養(yǎng)籠內(nèi)墊料每3天更換1次。

1.3.3 血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 心肌梗死模型組和假手術(shù)模型組大鼠飼養(yǎng)1周后，以3%戊巴比妥鈉按50 mg/kg的劑量腹腔注射麻醉，保持呼吸道通暢，進(jìn)行氣管切開(kāi)并插管；沿原切口進(jìn)胸，0.3%肝素鈉生理鹽水溶液抗凝，將2F聚乙烯導(dǎo)管自心尖插入左心室腔內(nèi)心底方向，連接壓力換能器和生物信號(hào)采集與處理系統(tǒng)；導(dǎo)入血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，記錄左心室壓力(LVP)曲線，分別獲取左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、頸總動(dòng)脈收縮壓(SBP)和舒張壓(DBP)檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)將LVP電信號(hào)同步輸入微分器，記錄曲線，計(jì)算LVP上升和下降的最大速率(±dp/dtmax)等參數(shù)。

1.3.4 TTC染色及HE染色 術(shù)后4周，采用尾靜脈注射10%氯化鉀(KCl)的方法處死大鼠，取出心臟，觀察外形特征后沿中線切開(kāi)。取部分心臟組織置37 ℃恒溫箱，于10 mL 1%TTC磷酸緩沖液(pH=7.4)中孵育10 min后取出，于35%～40%甲醛溶液中固定1 h以加強(qiáng)染色對(duì)比效果，待色差明顯后，取出左心室斷面，將切面展平。另取部分心臟組織，4%多聚甲醛固定后石蠟包埋、切片，切片厚度3 μm，行HE染色，中性樹(shù)膠封片；顯微鏡下觀察并照相。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 心肌梗死模型組入組SD大鼠20只，術(shù)中心跳驟停和室顫死亡2只，麻醉過(guò)量死亡1只，術(shù)后2周死亡1只，剩余16只大鼠存活4周，存活率80.0%。假手術(shù)模型組入組SD大鼠10只，術(shù)中心跳驟停死亡2只，剩余8只大鼠存活4周，存活率80.0%。

2.2 心電圖檢測(cè)結(jié)果 心肌梗死模型組大鼠術(shù)后第2、7天心電圖可見(jiàn)ST段明顯抬高。假手術(shù)模型組大鼠術(shù)后第2、7天心電圖未見(jiàn)明顯異常。心肌梗死模型組大鼠心電圖檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 心肌梗死模型組大鼠心電圖檢測(cè)結(jié)果

2.3 血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果 術(shù)后1周血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。心肌梗死模型組大鼠DBP、SBP、LVSP和±dp/dtmax均低于假手術(shù)模型組，心率和LVEDP則明顯升高，各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 TTC染色及HE染色結(jié)果 心肌梗死模型組大鼠心肌色澤變白，局部心肌運(yùn)動(dòng)減弱(見(jiàn)圖2A)。TTC染色可見(jiàn)梗死心肌、正常心肌色差明顯，壞死心肌呈白色，未壞死心肌呈紅色(見(jiàn)圖2B及圖2C)。HE染色可見(jiàn)正常心肌細(xì)胞呈梭形，緊密、規(guī)則排列(見(jiàn)圖2D)；梗死心肌細(xì)胞腫脹、排列紊亂，出現(xiàn)空泡，甚至斷裂，部分?jǐn)嗔研募〖?xì)胞間隙見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)圖2E)。

A為術(shù)后心臟外觀(上方箭頭所示為結(jié)扎區(qū)，下方箭頭所示為梗死區(qū))；B為梗死心肌TTC染色(箭頭所示壞死心肌，呈白色)；C為正常心肌TTC染色；D為正常心肌HE染色(200×)；E為梗死心肌HE染色(200×)。

圖2 TTC染色及HE染色結(jié)果表1 各研究組大鼠血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果

注：與假手術(shù)模型組比較，*P<0.05。

3 討 論

心肌梗死動(dòng)物模型不僅可用于缺血性心血管疾病發(fā)病機(jī)制的研究，更有助于開(kāi)展新型治療方法相關(guān)基礎(chǔ)研究。可用于制備心肌梗死動(dòng)物模型的方法較多，但各有利弊。本研究以Johns法為基礎(chǔ)，參考其他學(xué)者提出的制備方法進(jìn)行了適當(dāng)改進(jìn)，在大鼠自主呼吸條件下迅速開(kāi)胸，擠出心臟后結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支。與Johns法相比，本方法具有操作簡(jiǎn)單、創(chuàng)傷小、重復(fù)性好、成功率高等優(yōu)點(diǎn)。手術(shù)過(guò)程中采用異氟醚氣體麻醉，不僅確保了手術(shù)安全進(jìn)行，而且有助于大鼠在術(shù)后盡快蘇醒，在一定程度上能夠避免麻醉過(guò)深導(dǎo)致大鼠死亡。傳統(tǒng)方法采用戊巴比妥鈉按30～50 mg/kg的劑量進(jìn)行深度麻醉，有可能導(dǎo)致呼吸道分泌物過(guò)多，引起氣道堵塞和呼吸抑制。采用異氟醚氣體進(jìn)行麻醉時(shí)，大鼠在停止麻醉后極短時(shí)間內(nèi)即可蘇醒，促進(jìn)了自主呼吸能力的恢復(fù)，也增加了大鼠的存活率。

本研究采用鈍性分離的方法于第4肋間暴露心臟，不剪斷肋骨，創(chuàng)傷小，保持了大鼠胸部正常的解剖結(jié)構(gòu)，不影響其功能，有利于術(shù)后迅速恢復(fù)。同時(shí)，手術(shù)過(guò)程中心臟完全暴露于體外，手術(shù)視野大，便于結(jié)扎。傳統(tǒng)的心肌梗死動(dòng)物模型制備方法通常是在呼吸機(jī)支持下開(kāi)胸后結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，手術(shù)過(guò)程相對(duì)繁瑣，需插管后開(kāi)胸手術(shù)，耗時(shí)長(zhǎng)，且技術(shù)要求高，難于掌握。此外，采用該方法對(duì)動(dòng)物的創(chuàng)傷較大，心臟往往產(chǎn)生移位，易導(dǎo)致血流動(dòng)力混亂和心律失常等并發(fā)癥。采用傳統(tǒng)方法制備模型動(dòng)物時(shí)，手術(shù)操作及術(shù)后護(hù)理等因素對(duì)大鼠的存活率影響較大，如氣管切開(kāi)、氣管插管、面罩呼吸等。雖然術(shù)中采用呼吸機(jī)輔助呼吸可維持大鼠開(kāi)胸后的正常呼吸，但需要進(jìn)行氣管插管，增加了創(chuàng)傷和分泌物的產(chǎn)生，容易造成窒息。而且，經(jīng)口氣管插管相對(duì)較難，也增加手術(shù)時(shí)間和術(shù)中麻醉風(fēng)險(xiǎn)。

除麻醉方法、手術(shù)方案外，術(shù)中細(xì)節(jié)及處理、術(shù)后護(hù)理等因素對(duì)心肌梗死動(dòng)物模型的制備也比較重要。(1)手術(shù)創(chuàng)口不易過(guò)大，需要保證較快的分離速度；(2)心臟暴露時(shí)間直接影響大鼠存活率，因此應(yīng)盡可能縮短開(kāi)胸時(shí)間；(3)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈應(yīng)迅速、準(zhǔn)確，不可力度過(guò)大，盡量一次結(jié)扎成功，多次結(jié)扎可引起心律失常、失血過(guò)多等；(4)術(shù)中應(yīng)保持動(dòng)物體溫，必要時(shí)可采用燈光照射保溫的方法；(5)術(shù)中注意消毒，包括手術(shù)器械及術(shù)區(qū)消毒等；(6)術(shù)后可注射青霉素預(yù)防感染。在動(dòng)物模型制備過(guò)程中，只有完善各項(xiàng)準(zhǔn)備工作，認(rèn)真處理好每項(xiàng)問(wèn)題，才能增加手術(shù)成功率。

制備心肌梗死動(dòng)物模型是開(kāi)展心肌梗死發(fā)病機(jī)制和預(yù)防基礎(chǔ)研究，以及研究新型治療方法的第一步，采用快捷、安全的方法制備動(dòng)物模型，并提高動(dòng)物存活率尤為重要。本研究建立的方法效果理想且操作簡(jiǎn)單，適用于心肌梗死動(dòng)物模型的制備。

[1]Williams AR，Hatzistergos KE，Addicott B，et al．Enhanced effect of combining human cardiac stem cells and bone marrow mesenchymal stem cells to reduce infarct size and to restore cardiac function after myocardial infarction[J]．Circulation，2013，127(2)：213-223．

[2]Lilyanna S，Martinez EC，Vu TD，et al．Cord lining-mesenchymal stem cells graft supplemented with an omental flap induces myocardial revascularization and ameliorates cardiac dysfunction in a rat model of chronic ischemic heart failure[J]．Tissue Eng Part A，2013，19(11/12)：1303-1015．

[3]張玉玲，周淑嫻，雷娟，等．血管緊張素Ⅱ-1型受體拮抗劑對(duì)心肌梗死大鼠骨橋蛋白表達(dá)及膠原沉積的影響[J]．中國(guó)循環(huán)雜志，2007，22(4)：307-310．

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Establishment and assessment of rat model of myocardial infarction*

PEIZhi-jun，LIFu-yan，CHENYi-jia，WANGJun-jie，LIWei，WURui-min，YANGYi

(PETCenter，TaiheHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine，Shiyan，Hubei442000，China)

Objective To establish a new,fast and efficient preparation method of myocardial infarction model.Methods Sprague-Dawley rats were anesthetized by using isoflurane gas,then myocardial infarction models were prepared by ligation of ramus descendens anterior arteriae coronaria sinistrae,after bluntly separation of intercostal muscle.Sham operation rat models were prepared by punctuation,not ligation,of ramus descendens anterior arteriae coronaria sinistrae.Small animal electrocardiograph,hemodynamic analyzer,2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining and hematoxylin-eosin (HE) staining were used to identify myocardial infarction models.Results Survival rates of myocardial infarction models and sham operation models were both 80.0%.Electrocardiograph analysis indicated that ST segment was raised apparently in myocardial infarction models on 2 and 7 days after operation.Hemodynamic detection indicated that diastolic blood pressure,systolic blood pressure,left ventricular systolic pressure and max ascending and descending rate of left ventricular pressure in myocardial infarction models were lower than sham operation models,but heart rate and heart ventricle end diastolic pressure were higher (P<0.05).TTC staining showed that the color of infracted myocardium was white,which was obviously different with normal myocardium,HE staining showed that infracted cardiac muscle cells were swelling,disorderly arranged,with cavity or even break,and inflammatory cell infiltration could be found within intercellular spaces of fractured cardiac muscle cells.Conclusion Preparation method,constructed in this research,could be efficient and easily performed to establish myocardial infarction models.

myocardial infarction; experimental model; rat; coronary artery

國(guó)家自然科學(xué)青年基金資助項(xiàng)目(81401447)。

裴之俊，男，主治醫(yī)師，博士，主要從事分子影像學(xué)及干細(xì)胞治療研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.07.025

A

1672-9455(2015)07-0937-03

2014-10-15

2014-12-21)