外吐小體內microRNA-193b在阿爾茨海默病患者中的檢測*

劉辰庚，張躍其，王金玲，王培昌(首都醫科大學宣武醫院檢驗科，北京 100053)

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·論 著·

外吐小體內microRNA-193b在阿爾茨海默病患者中的檢測*

劉辰庚，張躍其，王金玲，王培昌△(首都醫科大學宣武醫院檢驗科，北京 100053)

目的 初步探討microRNA-193b(miR-193b)作為阿爾茨海默病(AD)生物標志物的潛在價值。方法 使用超速離心法提取癡呆期AD(DAT)患者和輕度認知障礙(MCI)患者和健康對照組血清和腦脊液外吐小體并檢測其miR-193b水平。結果 MCI和DAT患者腦脊液及血清外吐小體內miR-193b水平均低于對照組(P<0.05)，且DAT組低于MCI組，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論 腦脊液和血清外吐小體內miR-193b可能為AD，特別是早期診斷AD的標志物。

阿爾茨海默病； 外吐小體； 微小RNA； 生物標志物

阿爾茨海默病(AD)是老年癡呆癥中最為重要和常見的類型[1]。研究表明外吐小體內microRNA(miR)有作為疾病生物標志物的價值，且可能參與了細胞間的信號傳遞。本研究在前期研究的提示下，使用實時定量PCR檢測AD患者血清和腦脊液中外吐小體內和總體miR-193b的水平，初步探索外吐小體內miR-193b作為AD生物標志物的潛在價值[2]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年1月至2014年11月本院收治的AD患者共79例，其中輕度認知障礙期患者(MCI)43例，男25例，年齡中位數63歲；女18例，年齡中位數65歲。癡呆期患者(DAT)36例，男21例，年齡中位數72歲；女15例，年齡中位數75歲。MCI和DAT的診斷符合美國國立衛生研究院國立老化研究所和AD協會于2011年4月聯合發布，并經我國神經內科學會推薦的診斷標準[3]。另隨機選取性別、年齡匹配的健康者作為對照組。本研究內容已通過本院倫理委員會審核批準。

1.2 標本采集 受試者空腹12 h后分別使用肝素抗凝管和促凝管采集靜脈血，抽血后1 h內以3 000 r/min離心7 min，分離血漿或血清。男性患者8例(3例MCI，5例DAT)抽血后1 h內由神經內科醫生按照操作規程抽取腦脊液標本2 mL。標本在分析前保存于液氮中。

1.3 外吐小體提取 液氮中取出的標本分別置于-80、-20和4 ℃冰箱0.5 h緩慢復融，之后立即轉入玻璃試管。使用預冷的磷酸鹽(PBS)緩沖液將標本1∶1稀釋，4 ℃條件下3 000 r/min離心15 min；將上清轉移至超速離心管中，避免混入沉淀以防止細胞碎片污染；之后4 ℃條件下12 000 r/min離心30 min；小心吸出上清液，4 ℃條件下110 000 r/min離心1 h；棄上清液，加入5 mL預冷的PBS液并充分混勻；使用0.22 μm濾器過濾混合液；4 ℃條件下110 000 r/min離心30 min；棄上清液，加入5 mL預冷的PBS液，混勻后4 ℃條件下110 000 r/min離心30 min；棄上清液，加入100 μL預冷的PBS液重懸沉淀，即為外吐小體混合液[4]。

1.4 小RNA提取及miR-193b測定 使用天根公司(TIANGEN)miRcute miR親和柱提取小RNA，按說明書操作。每100 μL外吐小體PBS溶液加入100 μL裂解液，純化好的小RNA溶解于10 μL RNase-Free dd H2O 中；同時，提取腦脊液和血清標本中的總小RNA。20 μL逆轉錄體系中含RNA模板0.4 ng，RT Primer Mix 4 μL，5×RT Buffer 4 μL，RNase inhibitor 2 μL，dNTP(2.5 mmol/L) 2 μL，逆轉錄酶2 μL。20 μL miR檢測體系中含miR cDNA 1.0 μL，2×SYBR Green Mix 10.0 μL，相應上、下游引物各0.5 μL。反應條件：95 ℃，3 min；95 ℃，25 s；62 ℃，35 s；72 ℃，25 s，35個循環。以Ce_miR-39為內參，使用2-ΔΔCT法計算并統計miR-193b組間表達的差異[5]。

1.5 統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行數據處理及統計學分析，計量資料采用One-Way ANOVA分析，相同患者不同標本檢測結果的組間比較使用配對t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 血清、血漿標本相關性分析 同一受試者血清標本中總體miR-193b和外吐小體內miR-193b均略高于血漿，但差異無統計學意義(P>0.05)，其中對照4例，MCI 3例，DAT 3例；2種標本檢測結果均有相關性(r2=0.987)。見圖1。

注：1～4為對照組標本，5～7為MCI組標本，8～10為DAT組標本。

圖1 同一受試者血清(A)和血漿(B)標本中總體miR- 193b和外吐小體內miR-193b的比較(n=10)

注：與對照組比較，*P<0.05；與MCI組比較，#P<0.05。

圖2 MCI和DAT患者腦脊液總體miR-193b和 外吐小體內miR-193b水平檢測

注：與對照組比較，*P<0.05；與MCI組比較，#P<0.05。

圖3 MCI和DAT患者血清總體miR-193b和 外吐小體內miR-193b水平檢測

2.2 腦脊液標本檢測 MCI和DAT患者腦脊液總體miR-193b水平均低于對照組(P<0.05)，但MCI和DAT患者組間差異無統計學意義(P>0.05)；MCI和DAT患者腦脊液外吐小體內miR-193b水平均低于對照組，且DAT組低于MCI組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 血清標本檢測 MCI和DAT患者血清總體miR-193b水平與對照組差異無統計學意義(P>0.05)，MCI和DAT患者組間差異亦無統計學意義(P>0.05)；MCI和DAT患者血清外吐小體內miR-193b水平均低于對照組，且DAT組低于MCI組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

3 討 論

隨著研究的不斷深入，miR在AD發生和發展中的作用被更多地揭示，越來越多的研究結果提示相關miR表達的失控可能在AD中扮演了重要角色。miR在疾病中的改變主要包括在轉錄水平表達的上調或下調；參與miR轉錄后加工相關因子的表達失控而導致的miR轉錄后表達的上調或下調；以及miR基因的突變等。隨著芯片技術、高通量測序技術和實時熒光定量PCR技術的不斷進步和檢測成本的不斷降低，已有越來越多的研究著眼于探索miR這一潛在的疾病標志物。目前已經發現并被miR Base數據庫收錄的人類miR分子已近2 000種，其中絕大部分的miR分子在不同病理和生理狀況下都有表達，并且多數miR能夠在人體液中檢出[6-8]。

目前可能應用于AD診斷的標志物主要是蛋白類標志物，例如tau蛋白、p-tau蛋白、t-tau蛋白和BACE-1酶活性等，如前所述，這些蛋白在腦脊液中的陽性率和陰性率較為滿意，但在血液標本中則不甚理想。雖然腦脊液的生化改變較好地反映腦組織病理生理改變，但由于血腦屏障的存在，能進入外周血的生物大分子的數量遠少于其在腦脊液中的數量，使得豐度較低的腦源性標志物即使在血液中發生改變也難以被有效地檢出。而對于AD患者，特別是pre-MCI和MCI患者而言，對其進行CSF檢查往往得不到患者的理解，故尋找血液、尿液等更易獲得的體液標本中的AD標志物尤為關鍵。循環miR具有作為生物標志物的幾大優勢：首先，它們在血液中能穩定地存在，離體后也能在血液標本中保存較長時間，且其受pH值、溫度變化、反復凍融等影響較小[9]。其次，大多數miR在種屬間較為保守，這使得大部分在動物模型上初步發現的潛在miR標志物在人體內也能被檢測到。第三，以現在的分子生物學技術，大部分實驗室均能較好地進行血液標本miR的分離和定量檢測[10]。

困擾研究者的一大問題是miR的來源——相應miR的改變是不是疾病特異性的，是否受到健康組織正常代謝的影響。另外，目前認為體液中的miR除和一些蛋白結合而免于被降解之外，還能存在于外吐小體和微囊泡中。有學者甚至認為，細胞就是以外吐小體和微囊泡形式對外分泌miR，這些外吐小體和微囊泡可能包含了分泌細胞要傳達給外界的信息[11]。事實上，Benner[12]早在1988年就曾提出“細胞外通訊RNA”假說，并認為細胞外RNA在細胞增殖和分化中起重要作用。已有研究證實組成血腦屏障的內皮細胞能分泌微囊泡，但其是否能分泌外吐小體目前尚未見報道[13-14]。本研究結果提示，miR-193b在血清中的存在形式可能有2種——外吐小體內和外吐小體外，且miR-193b在腦脊液和外周血之間的轉移很可能主要以外吐小體為載體；換言之，組成血腦屏障的內皮細胞也能夠分泌外吐小體，這種含有不同濃度miR的外吐小體很可能包含了腦組織向外周組織所傳遞的信息。

本研究結果表明，MCI和DAT患者血清總體miR-193b的檢測結果與健康對照組差異無統計學意義，而當提取外吐小體檢測后發現，外吐小體內的miR-193b在MCI和DAT患者中均出現了明顯變化，且MCI患者血清外吐小體內miR-193b明顯低于DAT患者，提示外吐小體內miR-193b可能有助于AD的診斷，特別是早期診斷。結合腦脊液檢測結果，不難發現血清外吐小體內miR-193b的降低的原因之一可能是腦脊液向外周血分泌的外吐小體內miR-193b水平的降低。

綜上所述，血清外吐小體內miR-193b可能為AD，特別是早期診斷AD的標志物。

[1]Henriksen K,O′Bryant SE,Hampel H,et al.The future of blood-based biomarkers for Alzheimer′s disease[J].Alzheimers Dement，2014,10(1):115-131.

[2]Liu CG,Wang JL,Li L,et al.MicroRNA-135a and-200b,potential Biomarkers for Alzheimer′s disease,regulate β secretase and amyloid precursor protein[J].Brain Res，2014,(1583):55-64.

[3]賈建平,陸璐,張逸馳,等.美國國立老化研究所與阿爾茨海默癥協會診斷指南寫作組:阿爾茨海默癥源性輕度認知障礙診斷標準推薦[J].中華神經內科雜志，2012,45(5):345-351.

[4]Schageman J,Zeringer E,Li M,et al.The complete exosome workflow solution:from isolation to characterization of RNA cargo[J].Biomed Res Int,2013,2013(6):643-653.

[5]Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method[J].Methods，2001，25(4):402-408.

[6]Junn E,Mouradian MM.MicroRNAs in neurodegenerative diseases and their therapeutic potential[J].Pharmacol Ther,2012,133(2):142-150.

[7]Blennow K,Hampel H,Weiner M,et al.Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease[J].Nat Rev Neurol,2010,6(3):131-144.

[8]Rembach A,Faux NG,Watt AD,et al.Changes in plasma amyloid beta in a longitudinal study of aging and Alzheimer′s disease[J].Alzheimers Dement,2014,10(1):53-61.

[9]Mitchell PS,Parkin RK,Kroh EM,et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(30):10513-10518.

[10]Yu JT,Liu QY,Tan L,et al.Circulating miR-125b as a biomarker of Alzheimer′s disease[J].J Neurol Sci,2014,336(1/2):52-56.

[11]Kooijmans SA,Vader P,Van Dommelen SM,et al.Exosome mimetics:a novel class of drug delivery systems[J].Int J Nanomedicine,2012,7(9):1525-1541.

[12]Benner SA.Extracellular communicator RNA[J].FEBS Lett,1988,233(2):225-228.

[13]Dommelen SM,Vader P,Lakhal S,et al.Microvesicles and exosomes:opportunities for cell-derived membrane vesicles in drug delivery[J].J Control Release,2012,161(2):635-644.

[14]Lee TH,D′Asti E,Magnus N,et al.Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer--the emerging science of cellular debris[J].Semin Immunopathol,2011,33(5):455-467.

Detection of exosomal microRNA-193b in patients of Alzheimer′s disease*

LIUChen-geng,ZHANGYue-qi,WANGJin-ling,WANGPei-chang△

(DepartmentofClinicalLaboratory,XuanwuHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100053,China)

Objective To evaluate the potential value of microRNA-193b(miR-193b) as a biomarker in Alzheimer′s disease(AD).Methods The super centrifugation method was adopted to extract the exosome from serum and cerebrospinal fluid and the level of exosomal miR-193b was detected in the patients with mild cognitive impairment(MCI),patients with dementia of Alzheimer′s type(DAT) and healthy control group.Results The exosomal miR-193b levels in cerebrospinal fluid of the patients with MCI and DAT were significantly higher than that of the control(P<0.05),moreover the DAT group was lower than the MCI group(P<0.05).The exosomal miR-193b levels in serum of the patients with MCI and DAT were significantly lower than that of the control group(P<0.05).Conclusion The exosomal miR-193b in serum and cerebrospinal fluid may be a potential biomarker of AD,especially for its early stage.

Alzheimer′s disease; exosome; microRNA; biomarker

國家自然科學基金青年基金資助項目(81401734)；教育部博士點基金資助項目(20121107110001)。

劉辰庚，男，主管技師/講師，博士，主要從事衰老和相關疾病標志物篩選方面的研究。△

，E-mail:pcw1905@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.16.002

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1672-9455(2015)16-2301-03

2015-02-10

2015-05-10)