調節性T細胞CD4+CD25+CD127low在抗多耐藥肺結核治療中的意義*

范任華，向延根，楊 勵，劉艷科，尹 柯，封文軍，許憶新，謝和賓，傅滿姣，吳佳玲，王 雷，張 婷 (湖南省長沙市中心醫院 410004)

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·論 著·

調節性T細胞CD4+CD25+CD127low在抗多耐藥肺結核治療中的意義*

范任華，向延根，楊 勵△，劉艷科，尹 柯，封文軍，許憶新，謝和賓，傅滿姣，吳佳玲，王 雷，張 婷 (湖南省長沙市中心醫院 410004)

目的 探討調節性T細胞CD4+CD25+CD127low在西藥聯合中藥復方“益肺通絡方”抗多耐藥結核患者中的免疫調節作用。方法 選取多耐藥結核病(MDR-TB)住院患者34例，隨機分成標準化療(西藥)組12例作為對照組，中藥復方聯合西藥組22例作為試驗組，并簽署知情同意書，按臨床試驗方案抗結核治療，第0、3、6、9個月時分別采集2 mL肝素抗凝外周靜脈血，經CD4、CD25、CD127流式抗體標記后，Beckman流式細胞儀(FCM)計數各組CD4+CD25+CD127low百分比。結果 隨服藥時間推移，對照組MDR-TB患者CD4+CD25+CD127low調節性T細胞百分比下降，差異無統計學意義(P>0.05)；試驗組MDR-TB患者CD4+CD25+CD127low調節性T細胞百分比下降明顯，差異有統計學意義(P=0.007)；與對照組MDR-TB患者比較，試驗組MDR-TB患者CD4+CD25+CD127low調節性T細胞百分比下降，差異有統計學意義(P=0.047)。結論 經過9個月的抗結核治療，試驗組能有效降低MDR-TB患者CD4+CD25+CD127low調節性T細胞百分比，中藥復方可能協同西藥下調調節性T細胞的免疫抑制，恢復結核病患者機體免疫平衡狀態。因此，中藥復方聯合西藥抗多耐藥結核患者治療也許是一個有益的幫助。

調節性T細胞； 多耐藥肺結核； 抗結核治療

肺結核嚴重威脅人類健康，全球約有20億肺結核帶菌者，而我國結核患者人數居世界第二位，形勢非常嚴峻[1]。結核分枝桿菌對常用抗結核藥物構成抗藥性，導致發病率上升以及多耐藥結核菌株的出現，對現有的抗結核治療構成嚴重的挑戰[2-3]。結核病免疫功能紊亂涉及到特異性的細胞免疫、體液免疫和多種免疫調節因子，有不同程度的免疫功能低下或免疫抑制，單純抗結核藥物化療很難收到較好療效。因此，對結核病患者進行抗結核藥物化療外，輔以免疫調節功能的低不良反應的中草藥，恢復機體免疫功能平衡，增強患者對抗結核藥物的敏感性，達到抑制或殺滅結核菌，提高耐藥結核病的治愈率。因此，從天然藥物中尋找安全有效的抗結核藥物，用于臨床治療和輔助治療耐藥性結核病，具有重要的現實意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年11月至2014年9月本院收治的多耐藥結核病(MDR-TB)患者34例，其中男20例，女14例，平均(47.3±14.2)歲，隨機分成標準化療(西藥即對照)組12例、中藥復方聯合西藥即試驗組22例；臨床診斷根據臨床癥狀、體征、X線胸片、CT掃描、痰菌檢查，均符合中華醫學會結核病分類與診斷標準[4]。納入標準：所有納入研究對象均無心、肝、腎等臟器合并癥及其他感染，無糖尿病、自身免疫相關性或免疫性疾病，3個月內未用過免疫抑制劑及激素等藥物。納入研究對象簽署知情同意書，按臨床試驗方案分別標準化療(西藥)即對照組、西藥+中藥復方進行抗結核治療即試驗組，第0、3、6、9個月時分別采集2 mL肝素抗凝外周靜脈血。

1.2 儀器與試劑 采用Beckman-Coulter Epics XL流式細胞儀，流CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE、IgG1-FITC、IgG1-PC5、IgG1-PE、溶血劑OptiLyse C 均購自美國Beckman-Coulter公司。復方中藥“益肺通絡方”顆粒為本院自制顆粒劑。

1.3 方法 取2 mL靜脈血、肝素抗凝，混勻，各取50 μL全血于3支測定管，第l管加入IgG1-FITC、IgG1-PC5、IgG1-PE，第2管加入CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE單克隆抗體量均為20 μL，標記抗體和抗凝血混勻后，在室溫、避光15 min后，每管400 μL溶血劑OptiLyse C溶解紅細胞1 h，用側向散射光(SS)和前向散射光(Fs)圈門選取淋巴細胞群，以IgGl-FITC/IgGl-PE/IgGl-PC5為Treg細胞同型對照。分別檢測CD4+CD25+CD127lowTreg細胞百分比含量。

2 結 果

2.1 對照組不同時間點的各指標水平比較 對照組，第0、3、6、9個月時分別采集2 mL肝素抗凝外周靜脈血流式細胞術計數CD4+CD25+CD127lowTreg細胞，發現隨抗結核治療時間推移Treg細胞數量逐漸下調，當月(未抗結核治療)MDR-TB外周血CD4+CD25+CD127lowTreg細胞占CD4+T細胞總數的(10.01±4.40)%，高于第3個月的(9.03±3.50)%，第6個月的(8.33±3.39)%，第9個月的(7.10±3.74)%，各時間點比較差異無統計學意義(F=1.313,P=0.230)。

2.2 試驗組不同時間點各指標水平比較 試驗組，第0、3、6、9個月分別采集2 mL肝素抗凝外周靜脈血流式細胞術計數CD4+CD25+CD127lowTreg細胞，發現隨抗結核治療時間推移Treg細胞數量逐漸下調，當月(未抗結核治療)，MDR-TB外周血CD4+CD25+CD127lowTreg細胞占CD4+T細胞總數的(10.85±5.66)%，高于第3個月的(7.12±3.80)%，第6個月的(4.88±2.57)%，第9個月的(3.41±1.53)%，各時間點比較差異無統計學意義(F=12.317,P=0.007)。

2.3 2組結核患者不同時間點的外周血CD4+CD25+CD127low調節性T細胞水平比較 抗結核治療不同時間點CD4+CD25+CD127lowTreg細胞百分含量變化，差異有統計學意義(F=6.361,P=0.018)，對照組Treg細胞數量變化，差異無統計學意義(F=1.313P=0.230)；試驗組隨著抗結核治療時間推移Treg細胞數量逐漸下調，差異有統計學意義(F=12.317,P=0.007)。2組組間比較，CD4+CD25+CD127lowTreg細胞百分含量變化，差異有統計學意義(F=5.207,P=0.047)，分組與各時間點無交互效應(F=3.504,P=0.094)。見表1。

表1 抗結核治療前后不同時間點外周血CD4+CD25+CD127lowTreg細胞占淋巴細胞總數的百分比±s，%)

注：組內比較F=6.361，P=0.018；組間比較F=5.207，P=0.047。

3 討 論

近年中草藥在抗結核分枝桿菌、增強和(或)調節機體免疫功能、輔助治療結核病、減輕藥物的不良反應和對機體生理功能影響等方面已有一些研究[5-7]。復方中藥“益肺通絡方”顆粒為本院自制的專利配方顆粒劑，本院采用復方中藥“益肺通絡方”顆粒干預多耐藥結核病患者，取得了較好的臨床療效。

調節性T細胞CD4+CD25+CD127lowTreg與多種腫瘤以及慢性感染免疫抑制狀態有關。Treg細胞通過分泌抑制性的細胞因子、細胞接觸和誘導凋亡等方式發揮其免疫抑制的功能，進而間接抑制CD4+、CD8+T細胞特異性免疫[8-9]。研究發現，外科切除治療空洞型多耐藥肺結核后，Treg細胞數量減少，表明Treg細胞參與了多耐藥肺結核疾病進程[10]。本研究選取20例多耐藥結核病患者，按臨床試驗方案隨機分標準化療(西藥)組與中藥復方聯合西藥組，在第0、3、6、9個月時分別采集2 mL肝素抗凝外周靜脈血，流式細胞檢測T淋巴細胞發現，隨服藥時間推移，對照組MDR-TB患者外周血的CD4+CD25+CD127lowTreg百分比數量各月份略有下降；而試驗組MDR-TB患者外周血的CD4+CD25+CD127lowTreg百分比數量下降明顯，2組間的CD4+CD25+CD127lowTreg細胞百分比變化，差異有統計學意義(F=5.207,P=0.047)，表明中藥復方聯合西藥治療耐藥結核在下調免疫抑制細胞CD4+CD25+CD127lowTreg有較好的效果。同時，提示復方中藥“益肺通絡方”顆粒可能協同西藥打破MDR-TB組患者CD4+CD25+CD127lowTreg產生的免疫抑制。

綜上所述，復方中藥“益肺通絡方”可能協同西藥下調CD4+CD25+CD127lowTreg免疫抑制，提升報道。多耐藥結核病特異性的細胞免疫，發揮抗結核免疫調節作用。誠然，深入研究復方中藥在多耐藥結核病中的免疫調節作用或許是對抗耐藥結核治療是一個有益的幫助。

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Significance of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells in therapy of anti-MDR-TB*

FANRen-hua,XIANGYan-gen△,YANGLi△,LIUYan-ke,YINKe,FENGWen-jun,XUYi-xin,XieHe-bin,FUMan-jiao,WUJia-ling,WANGLei,ZHANGTing

(ChangshaCentralHospital,Changsha,Hunan410004,China)

Objective To investigate the immunomodulatory role of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells in Western medicine combined with Chinese medicine Compound Yifeitongluo Decoction for treating multi-drug resistant pulmonary tuberculosis.Methods 34 cases of multidrug-resistant TB (MDR-TB) were selected and randomly divided into the standard chemotherapy(Western medicine) group (12 cases,control group) and the Western medicine plus compound Chinese medicine group(22 cases,experimental group).The informed consent was obtained from all subjects and the anti-TB therapy was performed according to the clinical trial scheme.2mL of heparin coagulated peripheral venous blood was collected in 0,3,6,9 months.After CD4,CD25 and CD127 monoclonal antibody labeling,the percentage of CD4+CD25+CD127lowin each group was detected by using the Beckman flow cytometry (FCM).Results The percentage of CD4+CD25+CD127lowT cells in control group was declined with time lapse,but without statistical significance (P>0.05);which in the experimental group was decreased significantly (P=0.007);compared with the control group,the percentage of CD4+CD25+CD127lowT cells in the experimental group was decreased significantly (P=0.047).Conclusion After 9-month anti-TB therapy,the experimental group can effectively decrease the percentage of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells.The compound Chinese medicine could synergize the Western medicine to down-regulate the immunosuppression of regulatory T cells and recover the body immune balance of TB patients.Therefore,compound Chinese medicine combined with Western medicine may be a beneficial help to the anti-MDR-TB therapy.

CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells； multi-drug resistant pulmonary tuberculosis； anti-tuberculosis therapy

艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治科技重大專項2013年立項項目(2013ZX10005004)。

范任華，男，主管技師，博士，主要從事肺結核免疫調節方面的研究。

△通訊作者，E-mail:yanglicszxyy@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.16.004

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1672-9455(2015)16-2307-02

2015-02-10

2015-04-20)