無償獻血者乙肝表面抗原弱陽性標本不同檢測方法結果比較

程 穎,李 維，田耘博，程 燃(.重慶市血液中心檢驗科 40005；2.重慶市中山醫院 檢驗科 40004)

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·臨床探討·

無償獻血者乙肝表面抗原弱陽性標本不同檢測方法結果比較

程 穎1,李 維1，田耘博1，程 燃2△(1.重慶市血液中心檢驗科 400015；2.重慶市中山醫院 檢驗科 400014)

目的 比較酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、膠體金免疫層析技術(GICA)、電化學發光免疫分析(ECLIA)、核酸檢測(NAT)共4種方法檢測乙肝表面抗原(HBsAg)弱陽性標本的結果符合率，分析探討4種方法的特異性與靈敏度。方法 采用高靈敏度進口和國產ELISA試劑對重慶地區2013年1～12月無償獻血標本共116 351份進行HBsAg血液定性篩查，選取0.8≤S/CO

乙型肝炎病毒表面抗原； 酶聯免疫吸附試驗； 膠體金免疫層析技術； 電化學發光免疫分析； 核酸檢測

流行病學調查顯示，乙肝病毒感染廣泛分布于世界各地。在某些成人感染者中，病毒具有自限性,但有5%～10%的感染者表現為慢性肝炎癥狀，導致肝臟嚴重損傷，最終導致肝纖維化、肝硬化甚至肝癌[1]。因此，準確判斷是否感染乙型肝炎顯得尤為重要。乙肝表面抗原(HBsAg)是各采供血機構篩檢獻血者的必檢項目。我國現行的獻血法明確規定：為保證醫療臨床用血需要和安全，保障用血者身體健康，陽性標本必須報廢，不得用于臨床。目前檢測HBsAg的主要方法酶聯免疫吸附試驗(ELISA)簡便、快速、特異、成本低、且靈敏度較高，特別適用于大批量獻血者篩查及健康體檢[2]。由于人感染病毒后，在血液檢測時存在檢測的窗口期，使得病毒陽性的獻血者存在一定的漏檢概率，因此將試劑盒陽性判定值(cut off)下一段區域20%設定為弱陽性。“弱陽性”指在定性ELISA測定中處于cut off值附近臨床意義可疑的一部分結果,對弱陽性標本進行初復檢雙孔重新測定，其初復檢標本OD值仍為弱陽性的都視為陽性報廢，這樣也會造成很多“假陽性”的血液被報廢，使本身就缺血的重慶地區血液供應更加緊張[3]。為了既保證不浪費緊張的血液資源，又最大限度保障用血安全，作者選擇國內常用的4種檢測方法對收集的HBsAg 弱陽性標本進行測定．并對結果進行分析比較，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選取重慶市血液中心2013年無償獻血標本116 351份中抽取出的弱陽性標本150份，每位獻血者留取5 mL和8 mL乙二胺四乙酸二鉀抗凝血各1管，無分離膠的用于ELISA檢測，有分離膠的用于核酸檢測(NAT)，各樣品管的離心和保存均按相應的檢測試劑說明書要求進行操作。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 深圳愛康Xantus全自動加樣儀；瑞士FAME24/20和FAME24/30全自動酶免分析儀；PROCI EIX TIGRIS核酸檢測系統(美國諾華)；RT-2100C酶標儀及羅氏(Cobas)全自動電化學發光免疫分析儀；穿越信息管理系統軟件。

1.2.2 試劑 酶聯免疫試劑：ELISA試劑盒(生物梅里埃和北京萬泰)；膠體金試劑：膠體金免疫層析技術(GICA)試紙條(艾康生物)；電化學發光定量檢測試劑：電化學發光免疫分析(ECLIA)儀及其配套試劑(上海羅氏)；核酸試劑：乙型肝炎病毒核酸檢測(NAT)試劑盒(美國諾華)、HBsAg鑒別探針試劑。

1.3 檢測方法 將所有保存的弱陽性標本復融后，分別以ELISA試劑盒、GICA試紙條、ECLIA、NAT平行檢測HBsAg。

1.3.1 ELISA法 獻血者標本分別采用兩臺深圳愛康Xantus全自動加樣儀、兩種試劑同時進行加樣，采用瑞士FAME24/20和FAME24/30全自動酶免分析儀進行后處理檢測；采用海參威實驗室信息管理系統軟件接受處理檢測結果，本實驗室將弱陽性下限值設置為S/CO值=0.8，其中0.8≤S/CO<1.0設置為弱陽性,任意一種試劑S/CO≥0.8，均須用該試劑作雙孔復試，雙試劑S/CO≥0.8或單試劑雙孔復試至少一孔S/CO≥0.8即判為初篩呈反應性，該標本對應的血液報廢。

1.3.2 GICA法 GICA在15 min和30 min各觀測1次結果，以后者為報告結果，測定結果應在15 min內讀取，30 min后判定無效。

1.3.3 ECLIA法 將待測標本與生物素標記的單克隆抗體、三氯聯吡啶釕[Ru(bpy)3]標記單克隆抗體、鏈酶親和素標記磁性微粒加入到反應杯中共同溫育，形成磁性微珠包被抗體-抗原-發光劑標記抗體復合物。將上述復合物吸人流動室，同時用電子供體三丙胺(TPA)緩沖液沖洗。當磁性微粒流經電極表面時，被安裝在電極下的磁鐵吸引住，而游離的發光劑標記抗體被沖走。同時在電極加電壓，啟動電化學發光反應，使發光試劑標記物Ru(bpy)3和TPA在電極表面進行電子轉移，產生電化學發光，光的強度與待測的乙肝表面抗原的濃度呈正比。

1.3.4 NAT法 NAT檢測與結果判斷采用轉錄介導擴增(TMA)檢測技術進行NAT檢測。標本于生物安全柜內開蓋，置于樣品架，按照全自動血液病毒核酸檢測儀(Procleix UI TRIO Systern)的操作程序上樣，進行單人份NAT檢測。先用UI TRIO試劑在TIGRIS上做HIV RNA、HCV RNA、HBV DNA三聯檢測分析，對于UI TRIO有活性的標本，判為NAT聯檢陽性；再分別進行Procleix HIV、HCV 和HBV鑒別試驗(dHIV-1、dHCV 和dHBV)。

2 結 果

2.1 4種方法測定血清HBsAg弱陽性標本的結果比較 見表1。

表1 4種方法測定血清HBsAg弱陽性標本的結果比較(n)

2.2 以ECLIA為標準3種方法測定血清HBsAg的各診斷指標比較 見表2。

表2 3種方法各診斷指標比較(%)

3 討 論

HBsAg是一種22 nm的小球形顆粒，小球形顆粒是由100個HBsAg單體組成，乙肝患者血清中首先出現的病毒標志物就是表面抗原HBsAg，所以HBsAg對于乙型肝炎疾病的早期診斷和普查具有很高價值[4]。由于ELISA的影響因素較多，常規檢測中存在著一些介于陰性和陽性之間的弱陽性結果，且弱陽性標本日益增多,但對其沒有統一的判斷標準，從而造成血液制品的浪費。HBsAg弱陽性出現的原因比較復雜，目前研究發現可能存在以下幾個方面原因[5-8]：(1)HBVS基因的變異導致HBsAg結構及抗原性變異，使傳統檢測試劑靈敏度下降，出現假陰性或者弱陽性，而體內HBsAg實際上仍處于相當高的水平。(2)個體的免疫狀況存在差異，部分人群對HBV耐受，免疫應答水平低，因此使得S基因表達較低，但是疾病的預后和轉歸卻并不理想，甚至個別患者會出現持續性的肝損傷，更應引起臨床的重視。(3)不同的檢測方法、不同廠家的檢測試劑及檢測儀器和檢測環境的差異，對實驗結果產生嚴重的影響。所以，弱陽性標本檢測的準確性，對于采供血部門的質量管理來說是一個非常重要的控制點。

GICA是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術，多用于無償獻血現場的首選篩查方法。目前，國產的乙肝表面抗原膠體金試紙條檢測靈敏度已達到1 ng/mL，但是膠體金試紙條在前端采血中還是很多的缺點：(1)多數的快速診斷試劑是定性的，只能用于檢測標本中是否含有超過檢測濃度的特定生物成分存在，故它的靈敏度會受到一定限制和影響，在HBsAg檢測標本濃度較低時易出現假陰性導致漏檢。(2)由于檢測結果是肉眼進行判讀，較容易引起人為主觀判斷因素造成的差異。本實驗結果表明，GICA的靈敏性較ECLIA、ELISA、NAT低，是4種方法中靈敏度最低的，GICA適用于獻血前初篩檢測使用[9]。

ELISA是在免疫酶技術的基礎上發展起來的一種新型的免疫測定技術,是目前國內檢測HBsAg的常規方法，其優點在于快速、操作簡單、實驗設備要求簡單、應用范圍廣泛、敏感性高、特異性強、無放射性污染、能定性及半微量、微量、超微量定量分析等，是目前發展比較快的酶免疫學技術方法。但ELISA檢測HBV血清標志物的影響因素也非常多，受加樣、反應溫度、反應時間、洗滌徹底性等諸多因素的影響[10]。國產試劑之間、國產試劑及進口試劑與進口試劑間在檢測質量及結果判斷標準上均存在一定的差異，這主要是抗原抗體反應難于溯源及普遍存在的基質效應所造成，而且操作步驟繁瑣，整個實驗過程至少需要2 h左右，因此不適用于急診及無償獻血現場篩查。本研究結果顯示，ELISA法的靈敏度和特異性分別為90.2%和93.2%，比ECLIA略低，證明其還是存在漏檢風險。研究分析ELISA漏檢的原因，主要集中在窗口期、靈敏度、罕見的亞型、變異及免疫靜默感染幾個方面，其中窗口期漏檢是影響血液安全性的主要問題[11-13]。

免疫測定技術發展一日千里，化學發光技術、時間分辨熒光技術和電化學發光技術在體外診斷技術中逐漸占據主流地位。ECLIA應用較晚，但其發展卻很快[14]。ECLIA檢測HBsAg是目前世界上乙肝標志物檢測方法的金標準，該方法兼具免疫學反應和電化學發光的高特異性、靈敏性、精密度和準確度等優點，其測定結果較其他方法更穩定，線性范圍寬，抗干擾能力強，重復性好，并可單份檢測，檢測時間短，體現了ECLIA在方法學上的優勢及在臨床診斷上的重要價值[15]。本文的實驗結果證實ECLIA法檢測HBsAg弱陽性標本的靈敏性優于ELISA法、GICA法、NAT試驗，是4種方法中靈敏性最高的。但因為儀器昂貴、試劑成本較高等因素，僅用于針對弱陽性標本的檢測。

據資料文獻顯示，我國HBV感染者中，存在一部分血清HBsAg呈低水平狀態的個體，NAT能夠降低輸血殘余風險，保證輸血安全[16]。國內也有不少血液中心開始使用NAT技術應用于獻血者血液篩查。NAT包含多種直接檢測病原體核酸的方法，其中我國各血液中心最常用血液篩查NAT方法是聚合酶鏈反應(PCR)和TMA[17-18]。NAT靈敏度與特異性高，在病毒感染數天后即能檢出，可明顯縮短病毒感染的“窗口期”，可有效彌補其他檢測方法中存在的“窗口期”較長，病毒滴度、病毒變異、免疫沉默性感染和人為因素等原因而造成的漏檢[19]。NAT檢測與其他血清學方法相比較要求更嚴格：(1)試劑應具有較高的靈敏性、重復性、特異性；(2)實驗室環境、設備要求更高。(3)標本留樣和處理要求更高，因此NAT檢測得成本也較高。初步研究表明，ELISA檢測HBV“窗口期”約為45～55 d，采用混合標本NAT檢測，“窗口期”將縮短9 d。采用單人份NAT檢測，“窗口期”將縮短30 d[20]。NAT檢測最大的優勢在于可以縮減獻血者“窗口期”，減少受血者通過輸血途徑感染病毒的風險，但也不可避免有漏檢標本出現。NAT與ELISA所應用的檢測原理和檢測方法存在一定差異，NAT檢測的對象是病毒核酸，而ELISA檢測的對象是抗原或抗體，2種方法在檢測血液標本過程中存在一定的互補性，ELISA由于試劑、環境、設備等因素存在假陽性的可能；當獻血者血液中病毒載量低于NAT的檢出水平或病毒處在靜默期時，導致NAT出現假陰性。病毒由于長期存在于機體中，將會感染導致血液中抗體或抗原滴度相當高，雖然不會影響到ELISA的檢測，但血液中存在的HBsAg是由病毒DNA整合到人染色體與宿主基因共同表達所致，因此無法檢測到血清中病毒HBV DNA，造成NAT漏檢。現階段，國內大多數血站針對血液篩查呈陽性或弱陽性的標本，幾乎都未開展確證試驗，假陽性率過高不僅導致血液制品的浪費，同時也對獻血者的心理造成一定壓力，采供血機構在履行告知義務時感到十分尷尬，獻血者對血站檢測質量甚至對血站整體能力產生懷疑，給獻血者招募帶來負面影響，直接導致固定低危獻血者的流失，給無償獻血事業的可持續發展帶來嚴重影響。

綜上所述，以上4種檢測方法各有優缺點，又具有一定互補性。GICA初篩測定弱陽性的標本需用ELISA進行雙孔復檢，同時也可以用ECLIA復查；目前檢測HBsAg應用最為廣泛的方法是ELISA，因為其靈敏度、特異性較高且成本低廉，適合大批量標本檢測，但ELISA得影響因素諸多，檢測假陽性較高已無法適應現代醫學高速發展的步伐。現階段隨著免疫學技術飛速發展，速度更快、成本更低的新一代檢測方法不斷推出，使HBsAg滴度表達很低的標本得以檢出，最大限度地滿足定量檢測的要求。NAT與ELISA血液篩查檢測互補作用主要體現在3個方面：(1)窗口期漏檢是目前ELISA漏檢的最大因素。(2)以抗原抗體免疫反應技術基礎的ELISA方法對免疫靜默感染、病毒變異、病毒亞型檢測性能低。(3)ELISA檢測“弱陽性”的設置在理論上可以改善試劑檢測靈敏度低所造成的漏檢現象，卻依然無法改變因病毒變異、病毒亞型或“窗口期”而造成的漏檢。因此，采供血機構應合理開展多種方法聯合檢測，建立更科學的血液病原學篩查模式，最大限度降低血液制品不合理淘汰和資源浪費，降低輸血傳播疾病的風險。

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10.3969/j.issn.1672-9455.2015.16.060

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1672-9455(2015)16-2444-03

2015-02-28

2015-04-10)

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