人外周血淋巴細胞染色體標本的制備研究

徐本錦，劉 玲

(山西醫科大學汾陽學院，山西汾陽 032200 )

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人外周血淋巴細胞染色體標本的制備研究

徐本錦，劉 玲

(山西醫科大學汾陽學院，山西汾陽 032200 )

外周血淋巴細胞； 染色體； 分裂相； 秋水仙素

1960年，Moorhead等建立了一套比較完整的外周血體外培養和染色體制備方法，該技術能夠清晰的顯示染色體數目和結構上的變化，對于常見遺傳性疾病的快速診斷，提高人口素質具有十分重要的作用，對我國優生優育工作意義重大[1]。但該技術對細胞的培養時間較長，使得實驗易受溫度、pH、溶血和凝血等因素影響而導致失敗[2]。為了臨床上能高效、快速、準確地診斷遺傳性疾病，有學者已經報道了該技術的一些心得體會[3-5]。本研究立足于獲得高質量的人外周血染色體標本和提高實驗教學的可操作性，對該技術的4個影響因素進行了優化，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機選取8名健康男性和8名健康女性進行外周血采集，使用肝素抗凝。

1.2 儀器與試劑 培養箱，光學顯微鏡，香柏油，乙醇燈，離心機，恒溫培養箱，人外周血淋巴細胞培養液(湖南湘雅基因技術有限公司)，秋水仙素(20 μg/mL)，低滲液(0.075 mol/L 氯化鉀溶液)，固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)，Giemsa染液，500 U/mL肝素。

1.3 方法

1.3.1 實驗方法 采血：采用10 mL一次性注射器吸取少量肝素潤濕針管，將多余肝素排出。接種：在無菌條件下，用注射器針頭刺透培養瓶橡皮塞，向培養瓶內注入成年男子全血26滴，或成年女子全血28滴，輕輕搖勻。培養：將培養瓶放入37 ℃恒溫培養箱內培養72 h[6]。細胞同步化：外周血淋巴細胞培養68～70 h后，用5 mL注射器針頭加入5滴20 μg/mL秋水仙素，然后接著培養3～4 h[6]。細胞收集：從培養箱拿出培養瓶，搖勻之后直接倒入10 mL刻度離心管，以2 000 r/min離心10 min。低滲：棄上清，用注射器加入8 mL 37 ℃水浴的低滲液，混勻后37 ℃恒溫水浴30 min[6]。預固定：低滲結束后，立即加入1 mL固定液，混勻之后以2 000 r/min離心10 min。固定：棄上清，加入8 mL固定液，混勻后室溫固定30 min，然后以2 000 r/min離心10 min，棄上清。再固定：加入8 mL固定液，用吸管吹打，充分混勻后室溫靜置30 min或過夜。滴片：再次以2 000 r/min離心10 min，棄上清，然后每個離心管里加入5～6滴新鮮配制的固定液，吹打混勻制成細胞懸液。將細胞懸液3滴，滴到冰凍的載玻片上，滴片高度30 cm，隨即吹開，酒精燈上烘干，貼標簽。染色：用1∶10 Giemsa染液37 ℃條件下染色10 min，自來水沖洗，晾干后鏡檢[6]。

1.3.2 實驗原理 培養：人外周血淋巴細胞在體外培養72 h，大部分淋巴細胞處于增殖周期內。同步化：培養期間，利用秋水仙素對細胞進行同步化處理，使大部分細胞都停滯在有絲分裂的中期。低滲：淋巴細胞經低滲液處理，會吸水而脹破，釋放出染色體。固定：利用低滲液對染色體進行固定，有助于維持其完整的形態。染色：利用Giemsa染液對染色體進行著色，便于顯微鏡下觀察。

1.3.3 關鍵因素優化 通過文獻資料和筆者長期的實驗經驗，本研究選取了4個影響實驗結果的關鍵因素進行條件優化，分別對秋水仙素加入時間、低滲時間、固定時間和染色時間設定梯度，其他條件保持不變，通過多次嘗試和反復摸索，找到最佳時間組合，確定最優實驗條件。具體時間梯度如表1所示。

2 結 果

通過對秋水仙素加入時間、低滲時間、固定時間和染色時間進行優化，找到這4個影響因素的最佳作用時間分別為2.5 h、20 min、25 min和20 min。具體結果如圖1所示。

表1 4個關鍵因素的時間梯度

注：-表示無數據。

注：A1～A3表示優化后的染色體核型；B1～B2表示低滲時間小于或等于15 min；B3表示低滲時間等于20 min；C表示固定時間小于或等于20 min；D1表示染色時間小于或等于15 min；D2表示染色時間大于或等于25 min。

圖1 各類條件下的實驗結果(100×10)

3 討 論

人外周血染色體分析技術在遺傳性疾病的診斷中發揮著十分重要的作用，在一些醫院的生殖醫學科，該專門技術得到了廣泛的應用。隨著一些新的遺傳性疾病的報道及產前產后診斷的日益廣泛，診斷的高效率和準確結果的保障是該技術應用過程中亟待解決的問題。因此，有必要對影響實驗結果的關鍵因素進行優化，使其更好地服務于教學實驗或臨床。

該技術對細胞進行同步化、低滲和固定處理，從而獲得大量形態清晰、數目完整的優質分裂相。通過查閱文獻和筆者長期的實驗經驗，本研究選取了4個影響實驗結果的關鍵因素進行條件優化，分別是秋水仙素的加入時間、低滲時間、固定時間和染色時間。

秋水仙素是一種有絲分裂阻斷劑，通過抑制紡錘體的形成來阻止細胞分裂，可使細胞分裂停留在中期，從而得到大量的中期細胞[7]。若秋水仙素作用超時，一方面會對細胞產生毒性，影響細胞分裂，使分裂指數減少；另一方面，會使染色體縮短變粗，最終使染色體丟失而導致實驗失敗。因此，確定好秋水仙素的作用時間非常重要。通常認為，在終止培養前3～4 h內加入秋水仙素。實驗期間發現，秋水仙素的作用時間在1.5～4.0 h時，雖能在顯微鏡下找到理想的分裂相，但是，當時間小于等于2.0 h時，停滯在中期的細胞數目會減少，并且有相當數量的細胞處于其他分裂時期，這與謝志威等[8]報道的秋水仙素加入太少或處理時間偏短，可導致染色體形態偏長或無中期分裂相一致。當秋水仙素加入時間大于等于3.0 h時發現，大部分細胞處于分裂中期，但染色體變得又粗又短，不利于觀察。而當作用時間為2.5 h時，可獲得數目多、濃縮適中的染色體。

低滲處理的目的是誘導淋巴細胞吸水脹破，有助于染色體從細胞分散出來。低滲時間過長(45～60 min)，會導致染色體長度增加，黏度增大，影響分散程度，也不利于后續的顯帶。Henegariu等[9]認為低滲處理10 min就可以得到理想的結果。因此，低滲時間是本實驗成敗的一個關鍵。研究中發現，當低滲時間不超過15 min時，絕大部分細胞沒有破裂，形態完整，未能釋放出核內的染色體(圖B1)，偶爾也能看到幾條染色體，但數目不夠，有的染色體還被細胞膜或細胞質包裹，形態不清，這也許是細胞破裂不充分導致的(圖B2)，主要原因是低滲時間不夠，大部分細胞沒能充分與低滲液相互作用。若低滲時間超過25 min，則會使細胞過早破裂，導致染色體丟失。當低滲時間調整為20 min時，發現很多細胞破裂并釋放出染色體，達到了實驗要求(圖B3)。

染色體釋放出來之后，為了維持其形態，得到一個分散良好的分裂相，需要使用固定液對染色體進行固定操作。通過五個時間梯度的實驗發現，固定時間不超過20 min時，有的染色體散的太開，不利于觀察，或者相鄰2個細胞的染色體混在了一起(圖C)，無法辨別，不便于計數，也加大了后續核型分析的難度。當固定時間為25 min時，染色體分散良好，有很多完整的分裂相，且質量較高(圖B3)。

染色是本實驗的最后一步，通過4個染色時間的嘗試，結果顯示，染色時間不超過15 min時，染色體著色很淡，亮度不夠，甚至看不清楚(圖D1)，也不美觀。當染色時間大于等于25 min時，染色體又著色太深，形態不清晰，還會使玻片的背景過深，且不易沖洗，同樣對結果有很大影響(圖D2)。最終發現，當這4個時間分別為2.5 h，20 min，25 min和20 min時，能夠得到高質量的染色體(圖A1，A2和A3)。同時，在滿足上述條件的前提下，還應注意以下幾點：(1)淋巴細胞培養期間，要經常搖動培養瓶，避免培養基與細胞分層，影響細胞增殖。(2)為了獲得分裂指數較多，形態清晰，長短適中，分散良好的染色體，培養時間需在70～72 h。(3)收集細胞時，要搖勻培養液，然后將細胞和培養液全部轉入離心管，否則會造成細胞數量的減少。(4)離心后需棄去上清液的，應盡快除去上清液，否則會引起沉淀溶解，造成細胞丟失。(5)低滲液加入后，必須混勻完全，讓細胞與其充分接觸，否則會影響染色體的釋放。(6)滴片時必須使用冰凍的載玻片，且滴片高度在30 cm左右，否則會影響染色體的分散程度[10]。

綜上所述，經過反復摸索，本研究得到了高質量的中期染色體，這不僅有助于后續的顯帶和核型分析，也有助于實驗教學的順利開展。然而，外周血染色體制備技術目前還沒有統一的質量控制體系，該技術所用試劑的濃度、生產廠家，以及實驗室條件和設備等諸多因素參差不齊，再加上人為因素等，均會對染色體的質量產生影響。因此，無論是科技工作者還是醫務人員，都應本著相互學習的態度，取長補短，以獲得高質量的染色體標本。

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10.3969/j.issn.1672-9455.2015.15.070

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1672-9455(2015)15-2296-03

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