載吉西他濱磁性含鐵納米微球治療胰腺癌細胞的體外研究

溫苑章，徐繼威，宋 越，張賀云，周嘉嘉，陳汝福，王 捷△

(1.廣東省梅州市人民醫院普外一科 514089；2.中山大學孫逸仙紀念醫院肝膽外科，廣州 510120)

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·論 著·

載吉西他濱磁性含鐵納米微球治療胰腺癌細胞的體外研究

溫苑章1，徐繼威1，宋 越1，張賀云2，周嘉嘉2，陳汝福2，王 捷2△

(1.廣東省梅州市人民醫院普外一科 514089；2.中山大學孫逸仙紀念醫院肝膽外科，廣州 510120)

目的 制備載吉西他濱磁納米微球(Gem-CCMN)，考察其協同恒定外磁場下對人胰腺癌細胞CAPAN-2的體外殺傷效應。方法 采用化學共價耦聯法制備Gem-CCMN，掃描電子纖維鏡(SEM)觀察納米粒形態，紫外分光光度計法測定載藥量及包封率，體外考察 Gem-CCMN在擬溶菌酶存在的不同pH值下藥物累積釋放率，MTT法檢測協同恒定外磁場下 Gem-CCMN對CAPAN-2體外增殖的抑制效應，流式細胞術(FCS)檢測細胞凋亡。結果 Gem-CCMN呈球形，平均粒徑約為50 nm，載藥量為15%，包封率為45%，pH=7時48 h累積釋放量僅25%，pH=2時藥物累計釋放率可達84%；Gem-CCMN協同外磁場時可增強對腫瘤細胞增殖的抑制作用，誘導細胞凋亡和壞死。結論 Gem-CCMN聯合外磁場可有效抑制 CAPAN-2細胞的生長。

吉西他濱； 納米； 胰腺癌； CAPAN-2； 殺傷

吉西他濱(Gem)是食品和藥物管理局批準的用于治療進展期胰腺癌的一線用藥，對胰腺癌單一或聯合其他抗癌藥物都取得很高的療效[1]。但Gem不良反應大，體內代謝快，血漿半衰期短，僅 1.5 h。磁導向抗腫瘤靶向治療是一種新興的腫瘤靶向治療方法，將化療藥物、磁性內核包入高分子材料中制成的納米微球中，注入體內后，在體外磁場的作用下滯留于靶區，平穩釋放藥物殺傷腫瘤細胞，同時降低藥物不良反應[2]。本實驗以生物可降解材料羧甲基殼聚糖為原料，包裹磁性納米 Fe3O4，采用化學共價耦聯法制備吉西他濱-羧甲基殼聚糖氧化鐵納米微球(Gem-CCMN)，考察協同恒定外磁場條件下，對人胰腺癌細胞 CAPAN-2 的體外殺傷效應。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 鹽酸Gem購自上海英軒醫藥科技有限公司；自制枸櫞酸鈉穩定的磁流體(30 mg/mL)，正硅酸乙酯(TEOS)、3-三乙氧基硅基甲基丙烯酸酯(MPS)、N-乙基-N′-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)均購自汕頭市光華化學廠；RPMI 1640為美國 Gibco 產品；噻唑藍(MTT)購自美國 Sigma 公司；Annexin-V/PI 雙染試劑盒購于深圳晶美公司；胰腺癌細胞 CAPAN-2 購于中科院上海細胞庫。EQUINOX55 型傅立葉變換紅外光譜儀(德國 Bruker公司)；掃描電子纖維鏡(SEM,QUANTA 400，UK)；Spectrumlab52 型紫外分光光度計(上海棱光技術有限公司)；Model-680 酶標儀購于北京金輝盛業科技有限公司；FACSCalibur 型流式細胞儀購于美國 BD 公司；釹鐵硼稀土永磁體購于廣州釹磁鐵廠。

1.2 方法

1.2.1 磁性馬來酰化羧甲基殼聚糖微球(CCMN)的制備 取2.0 mL磁流體超聲分散于200 mL含有5.0 mL 氨水的醇/水(V/V=4∶1)的混合液中，機械攪拌下將混合體系升溫至40 ℃，并加入TEOS 0.5 mL反應12 h，在外加磁場作用下(6 000 G)收集產物Fe3O4@SiO2，去離子水和乙醇反復洗滌后分散于含有2.0 mL 氨水的乙醇中，加入過量的MPS,室溫下機械攪拌48 h 后，外加磁場作用下(6 000 G)從反應液中分離產物Fe3O4@SiO2@MPS，去離子水反復洗滌并分散于去離子水中，濃度為20 mg/mL；取 2.0 mL 的Fe3O4@SiO2@MPS分散液，加入到含有MCS 0.04 g 和KPS 5 mg的水溶液中，機械攪拌分散，通氮氣30 min后，升溫至70 ℃反應4 h后于外加磁場作用收集產物CCMN，并用去離子水多次洗滌，并重新分散于水中，濃度為20 mg/mL。

1.2.2 Gem-CCMN的制備 在室溫下，取Gem鹽酸鹽(0.37 g，1.2 mmol)溶于5 mL含有EDC 0.5 g 和NHS 0.1 g的水溶液中，并將該反應液滴加于 5 mL 上述CCMN 的分散液中，避光機械攪拌反應48 h，反應結束后，在外加磁場作用下得到產物，去離子水反復洗滌后，放入冷凍干燥機內在-40 ℃下真空干燥，稱質量，備用。

1.2.3 Gem-CCMN納米特征檢測 將真空干燥后的Gem-CCMN微球與KBr 研磨并壓片，在傅立葉變換紅外光譜(FTIR，Nicolet，USA)測定紅外透射譜圖。將真空干燥后的Gem-CCMN微球滴在玻璃片上，自然干燥后表面噴金處理，用SEM 觀察形態、粒徑及粒徑分布。

1.2.4 Gem-CCMN載藥量及接枝率測定 取2 mL上述反應后的液體，離心，紫外分光光度計測定其在267.6 nm下的吸光度值，根據標準曲線計算殘液中Gem的含量，根據公式計算Gem-CCMN的包封率及載藥量，公式如下。公式：包封率=(Gem總量-殘液Gem含量)/Gem總量×100%；載藥量=(Gem總量-殘液Gem含量)/ Gem-CCMN重量×100%。

1.2.5 Gem-CCMN的體外藥物釋放 取Gem-CCMN 0.5 mg加入5 mL濃度為0.1 mg/mL的胰蛋白酶的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液中，并在37 ℃的恒溫水浴中振蕩，分別加入1.0 mol/L的HCl或1.0 mol/L的NaOH調節溶液的pH至2、3、4、5、7.4，培育不同時間后，用6 000 G磁場及2 000 r/min離心分離出上層懸浮液，測定其在267.6 nm下的吸收度值，取3次實驗平均值，根據標準曲線計算出懸浮液中Gem的累積釋放量。

1.2.6 MTT法測定Gem-CCMN對胰腺癌細胞CAPAN-2的增殖抑制率 取對數生長期的CAPAN-2細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化后制成1×104/mL的細胞懸液，接種于96孔培養板中，200 微升/孔，37 ℃、5%CO2條件下培養24 h。實驗分為a：NS陰性對照組；b：CCMN空載對照組；c：單純磁場組；d：Gem陽性對照組；e：Gem-CCMN治療組；f：Gem-CCMN聯合磁場治療組，同時設空白對照組，每個亞組設5個平行孔。磁場強度為6 000 G，藥物組含Gem量為16 μg/mL。培養48 h后，加MTT(5 mg/mL)20微升/孔，繼續培養4 h；吸除各孔原液，加入二甲基亞砜(DMSO)150微升/孔，振蕩混勻10 min，酶聯免疫監測儀測定492 nm各孔A值。計算各組的增殖抑制率。抑制率=1-實驗組平均A值/陰性對照組平均A值×100%。

1.2.7 流式細胞術檢測CAPAN-2 凋亡 CAPAN-2細胞以1×105/mL細胞懸液孔接種于6孔板內，無血清培養液培養24 h使絕大多數細胞處于G0/G1期同步化。每孔分別加入含Gem(16 μg/mL)的培養液，以NS為空白對照(A)，分為單純Gem治療組(B)、Gem-CCMN組(C)以及Gem-CCMN聯合磁場治療組(6 000 G)(D)。培養48 h后胰酶消化收集細胞，PBS吸兩遍，結合緩沖液懸浮細胞，調整細胞濃度為1×106/mL，取195 μL 的細胞懸液加入5 μL Annexin V/FITC，室溫避光孵育10 min，190 μL結合緩沖液洗滌并重新懸浮細胞后，加入10 μL、20 μg/mL 的PI，每組重復3 次，1 h內檢測凋亡和壞死細胞。

2 結 果

2.1 Gem-CCMN的紅外光譜圖 從紅外光譜中看到在1 621 cm-1和1 529 cm-1處出現了兩個尖銳的峰是-CONH-的特征吸收峰，提示Gem在EDC的作用下其氨基和磁性粒子表面的羧基進行了反應。591 cm-1處為Fe的特征吸收峰。見圖1。

圖1 Gem-CCMN的紅外光譜圖

2.2 Gem-CCMN載藥量及接枝率測定 經紫外分光光度計測定Gem-CCMN載藥量約為15%，接枝率約為45%。

2.3 Gem-CCMN的SEM形態 從SEM照片中可以看出制備Gem-CCMN為球形或近似球形納米粒子，粒徑較均勻，平均直徑約為50 nm。

2.4 Gem-CCMN體外藥物釋放 各組的累積藥物釋放率見圖2。從圖中可見微球12 h 就能達到藥物的最大釋放率，pH=2時藥物 48 h 最大的累積釋放率達84%，而 pH=7.4時僅為25%。表明Gem-CCMN在 pH=7.4時較為穩定，而 pH=2 時溶菌酶活性高，可充分水解Gem-CCMN的肽鍵(-CONH-)釋放Gem。

圖2 各組的累積藥物釋放率

2.5 MTT法測定Gem-CCMN對胰腺癌細胞CAPAN-2的增殖抑制率 各組的CAPAN-2增殖抑制率見表1。通過單因素方差分析，結果表明Gem及Gem-CCMN均明顯抑制CAPAN-2細胞的生長，但差異無統計學意義(P>0.05)。而Gem-CCMN聯合磁場對CAPAN-2的抑制作用明顯高于其他治療組，差異有統計學意義(P<0.05)。但CCMN空載治療組與NS治療組差異無統計學意義(P>0.05)，提示CCMN作為藥物載體具有良好的生物相容性。各組CAPAN-2細胞活力，Gem-CCMN聯合磁場處理CAPAN-2細胞活力明顯高于其他治療組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 CAPAN-2增殖抑制率MTT分析

注：f組與其他組比較，P<0.05；d組和e組比較，P>0.05；a組和b組比較，P>0.05。-表示無數據。

2.6 流式細胞術檢測CAPAN-2凋亡 各組的CAPAN-2的凋亡壞死率見表2。從表2中可以看出，B、C、D組細胞凋亡、壞死率均高于A組(P<0.05)，B組與C組差異無統計學意義(P>0.05)，而D組凋亡、壞死率均高于其他治療組，差異有統計學意義(P<0.05)。提示Gem-CCMN聯合磁場可明顯誘導CAPAN-2 細胞發生凋亡及壞死。

表2 CAPAN-2凋亡率和壞死率流式細胞術分析

3 討 論

3.1 Widder早在1978年就提出“磁控納米靶向載藥系統”的概念[3]。近幾十年來隨著生物技術以及納米技術的飛速發展，磁控納米載藥系統的研究發展到了一個新的高度，但良好的生物相容性仍是納米醫用材料的首要必備條件[4]。本實驗采用殼聚糖是天然堿性多糖,是甲殼素脫乙酰基的產物,具有良好的生物相容性和生物可降解性,在體內能被溶菌酶等降解,降解產物能完全被人體吸收,無不良反應[5]。而選用的鐵磁流體乃人體必需元素，少量應用對人體無不良反應[6]。而MTT結果也顯示：單純的CCMN納米微球對CAPAN-2 細胞生長無明顯抑制作用，提示CCMN可作為良好的靶向給藥載體。

3.2 Gem又名2′-脫氧-2′,2′-二氟胞苷，是一種具有抗癌活性的脫氧胞苷酸類似物，屬細胞周期特異性抗腫瘤藥，是臨床治療胰腺癌的有效藥物之一[7-9]。Gem在進入細胞之前通常以無活性的形式存在，在細胞內由核苷激酶代謝成有活性的二磷酸核苷(dFdCDP)和三磷酸核苷(dFdCTP)，聯合抑制細胞DNA的合成[10]。本實驗采用化學共價耦聯的方法，通過肽鍵(CONH)將Gem共價耦聯于CCMN微球上，制備出Gem-CCMN納米微球，其平均粒徑約為50 nm，載藥量達15%，具有磁響應性強以及長時間藥物緩釋的優點；體外釋放實驗證實Gem-CCMN可避免在生理pH=7.4條件下被降解，可保證Gem-CCMN以有活性形式釋放于細胞內，達到細胞內靶向給藥的目的，提高細胞內藥物濃度，增加療效。同時該納米微球保持Gem抗癌活性，MTT結果顯示Gem-CCMN對CAPAN-2的增殖有明顯的抑制作用，和相同濃度的Gem治療組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。流式細胞術結果也證實Gem-CCMN具有良好的抑瘤作用，聯合磁場可明顯增加Gem-CCMN的抑瘤作用(P<0.05)，除Gem-CCMN具有緩釋效果外，磁場還可通過影響細胞生物膜的電位、通透性以及酶活性的改變，以增加藥物對腫瘤細胞的殺傷效應。

3.3 本實驗制備了一種新的磁納米載藥體系Gem-CCMN，體外實驗證實其具有良好的安全、緩釋、磁響應性，能有效抑制腫瘤細胞生長，誘導細胞凋亡及壞死，為進一步的體內磁靶向治療提供了實驗依據。

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In vitro study on gemcitabine carryingg iron-containing magnetic nanoparticles in treating pancreatic carcinoma cells

*WENYuan-zhang1,XUJi-wei1,SONGYue1,ZHANGHe-yun2,ZHOUJia-jia2,CHENRu-fu2,WANGJie2△

(FirstDepartmentofGeneralSurgery,MeizhouMunicipalPeople′sHospital,Meizhou,Guangdong514089,China;2.DepartmentofHepatobiliarySurgery,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou,Guangdong510120,China)

Objective To prepare the gemcitabine carrying magnetic nanoparticles (Gem-CCMN) and to investigate their in vitro killing effects on pancreatic carcinoma cell line CAPAN-2 in collaboration of the constant external magnetic fields.Methods Gem-CCMN was prepared by the chemical covalent linkage coupling procedure.Its morphology was observed by scanning electron microscope(SEM).The drug loading amount and encapsulating ratio were determined by the ultraviolet spectrophotometry.The accumulating release rate of Gem-CCMN under different pH values in the existence of lysozyme was investigated in vitro.The in vitro growth inhibiting effect of Gem-CCMN on CAPAN-2 under the collaborative constant external magnetic field was detected by the MTT assay.The apoptosis of CAPAN-2 was detected by the flow cytometry.Results Gem-CCMN were spherical with average diameter of 50 nm,the drug loading amount was 15% and the encapsulating ratio was 45%.The 48 h cumulative drug release amount at pH=7 was only 25%,but which at pH=7 could reach 84%;Gem-CCMN collaborated with external magnetic fields could enhance the killing effect on CAPAN-2,also induced the cellular apoptosis and necrosis.Conclusion Gem-CCMN combined with external magnetic fields could effectively inhibit the growth of CAPAN-2 in vitro.

gemcitabine; nanoparticles; pancreatic carcinoma; CAPAN-2; killing

國家重大專項課題 (2012ZX10002～016)；中山大學臨床研究5010項目(2010009)。

溫苑章,男，碩士研究生，主治醫師，研究方向為肝膽胰腺腫瘤的診治。△

，E-mail：wangjiesunyatsen@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.14.003

A

1672-9455(2015)14-1984-03

2015-02-20

2015-03-15)