rs1122608多態性與中國漢族人血脂水平的關聯研究

程小歡,李祖華,鄭 芳

(武漢大學中南醫院臨床基因診斷中心/檢驗科 430071)

?

·論 著·

rs1122608多態性與中國漢族人血脂水平的關聯研究

程小歡,李祖華,鄭 芳△

(武漢大學中南醫院臨床基因診斷中心/檢驗科 430071)

目的 探討rs1122608(G/T) 位點多態性與中國漢族人群血脂水平的關聯性。方法 在中南醫院體檢中心收集高脂血癥患者204例作為高脂血癥組，健康者187例作為健康對照組。用全自動生化儀檢測血脂水平，采用聚合酶鏈反應-高分辨率熔解曲線分析技術(PCR-HRM)檢測rs1122608(G/T)多態性。比較高脂血癥組和健康對照組間等位基因和基因型的分布差異，同時比較不同基因型亞組之間血脂各指標的差異。結果 高脂血癥組與健康對照組GG型、GT型和TT型頻率比較，差異無統計學意義(P>0.05)，基因型亞組間各血脂指標總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)差異也無統計學意義(P>0.05)。結論 rs1122608(G/T)多態性與中國漢族人群血脂水平無明顯相關性。

高脂血癥； 單核苷酸多態性； 高分辨率熔解曲線

大量研究發現，血液中總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)升高，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)降低是冠心病的重要風險因素[1-2]。目前人們已通過全基因組關聯分析(GWAS)發現了大量與血脂相關的遺傳易感位點[3]。但這些位點多在歐美白種人中發現與血脂相關，在亞洲人群中的驗證還不充分。由于遺傳特征及其對表型的影響存在種族差異，因此鑒定與漢族人群血脂相關的位點尤為重要。rs1122608位于低密度脂蛋白受體(LDLR)基因附近的SMARCA4基因上。國外研究發現在歐美人群中該位點與LDL-C水平相關[4]。2009年在Nature Genetics上發表了一項早發性心肌梗死的全基因組關聯研究，其中rs1122608被進一步發現與高加索人群中早發性心肌梗死明顯關聯[5]。2010年發現該位點與中國漢族男性心肌梗死明顯相關[6]。由此推測，該位點可能與中國漢族人血脂水平相關。為此，本文研究了rs1122608(G/T)的基因多態性及其與血脂水平的相關性，旨在觀察其對漢族人群血脂水平的影響，評估患高脂血癥的風險。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2012年11月至2013年7月于中南醫院體檢中心收集高脂血癥患者204例作為高脂血癥組，健康者187例作為健康對照組。根據中國成人血脂異常防治指南[7]，達到高脂血癥標準為TC≥6.22 mmol/L、LDL-C≥4.14 mmol/L、HDL-C<1.04 mmol/L、TG≥2.26 mmol/L，其中1項或幾項符合即可；健康對照組為血脂水平正常的體檢人群。所有受試對象均排除甲狀腺功能亢進、甲狀腺功能減退、慢性肝病、糖尿病、糖尿病腎病、腎病綜合征、腎移植術后等影響脂類代謝的疾病，排除使用影響糖脂代謝藥物者。兩組研究對象的一般臨床資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

1.2 方法

1.2.1 血脂水平檢測 采集受試者空腹12 h以上靜脈血3 mL，肝素抗凝，在全自動生化分析儀(雅培全自動生化分析儀)用酶法檢測TC、LDL-C、HDL-C和TG。

1.2.2 基因組DNA制備 采集受試者靜脈血2 mL 乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)抗凝，采用蛋白酶K法提取基因組DNA，通過電泳鑒定DNA提取成功，通過Nanodrop2000微量紫外分光光度儀測定提取基因組DNA的濃度和純度，終濃度為50～100 ng/μL，純度OD 260/280為1.5～2.0。

1.2.3 PCR擴增和高分辨率熔解曲線分析 根據引物設計原則，用LSPDS軟件設計PCR-HRM引物序列，由武漢擎科新業生物技術有限公司合成。正向引物：5′-GCT CTC ATT TCG TCG TGT AAA AG-3′，反向引物：5′-TGC CCC AAC ACT GCG AG-3′。PCR-HRM反應體系總體積10 μL，其中25 mmol/L Mg2+0.8 μL，2 mmol/L dNTPs 0.2 μL，10 pmmol/uL正、反向引物各0.5 μL，1 U/μL Taq酶1 μL，10×Buffer 1 μL，DNA模板1 μL，LC熒光1 μL，ddH2O 4 μL。PCR反應條件為預變性95 ℃，10 min，然后95 ℃，20 s、56 ℃，20 s、72 ℃，30 s行50次循環，最后進行72 ℃，10 min延伸。通過LightScanner32高分辨率熔解曲線儀掃描得到熔解曲線(LightScanner32 高分辨率熔解曲線儀由武漢大學中南醫院科研中心提供)。

1.2.4 測序驗證 隨機選取一部分樣本進行PCR-HRM，從中選取熔解曲線不同的樣本行普通PCR，擴增產物由武漢擎科新業生物技術有限公司測序確定基因型。

1.3 統計學處理 用PLINK和SPSS 16.0軟件對數據進行分析。用Hardy-Weinberg進行遺傳平衡校驗，用方差分析對兩組基因型和血脂水平進行比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

表1 高脂血癥組和健康對照組的一般資料

2 結 果

2.1 PCR-HRM和測序驗證結果 不同基因型的樣本熔解曲線見圖1(A)，對于不同熔解曲線的樣本測序驗證的結果見圖1(B、C、D)，分別顯示的是GG、GT、TT基因型。

注：A為3種基因型樣本的熔解曲線；B為GG型基因型的測序驗證圖，黑色箭頭指向G等位基因；C為TT型基因型的測序驗證圖，黑色箭頭指向T等位基因；D為GT型基因型的測序驗證圖，黑色箭頭指向GT雜合基因。

圖1 3種不同基因型樣本的擴增熔解曲線與其對應的測序結果圖譜

2.2 高脂血癥組和健康對照組各基因型血脂水平的比較 利用PLINK進行Hardy-Weinberg檢驗，高脂血癥組P=0.83，健康對照組P=0.19，表明樣本來自一個隨機婚配的群體，不存在抽樣誤差。兩組年齡比較P=0.534，性別比較P=0.372，均差異無統計學意義(P>0.05)。高脂血癥組與健康對照組等位基因和基因型的分布差異見表2。各組的各基因型之間的血脂水平比較見表3。兩組各基因型間，血脂水平之間均差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 高脂血癥組與健康對照組等位基因和基因型的比較[n(%)]

表3 高脂血癥組與健康對照組各基因型亞組血脂水平的比較

3 討 論

心腦血管疾病一直是威脅人類健康的重要殺手之一，而心血管疾病的風險因素很多，其中高脂血癥是主要的一個危險因子[7]。因此通過對血脂的遺傳特性研究，有望尋找降低心血管疾病的預防方案。近年來，隨著高通量技術的發展，通過GWAS已發現多個血脂關聯的SNPs位點，在歐洲白種人群中的大量研究表明部分與血脂關聯的SNPs大都與心血管疾病的發生與進展存在關聯性[8]。在中國人群中也發現部分與血脂關聯的SNPs與冠心病存在相關性[9]。

本文研究的SNP位點rs1122608(G/T)位于LDLR附近SMARCA4 基因的30號內含子上，SMARCA4基因距LDLR基因僅36 kb。該基因也被稱為BRG1(brm/SWI2-related gene 1)，位于19p13.2，包含36個外顯子，編碼SWI/SNF核染色質重組復合體的一個主要催化亞單位，參與干細胞更新和分化，誘導譜系特異性基因程序[10]。2009年Knouff等[5]首先通過GWAS發現rs1122608與心肌梗死相關。該位點在俄羅斯人群中是心肌梗死的高風險因子，但與漢族人群的心肌梗死相關性不明顯[11]，且與歐洲白種人LDL-C和冠心病關聯[4]。在伊朗人群的研究文獻中也提示rs1122608 (GT或TT) 與冠心病的嚴重程度相關，與多根血管的受累的相關度更高[12]。與本課題研究幾乎同期的，關于中國漢族人群冠心病rs1122608(G/T)的病例-對照研究和meta分析報道，顯示此位點與漢族人群冠心病發生無明顯相關[13]，在此研究中討論了SNP與多種心血管疾病的關系。而本研究著重于SNP與高血脂尤其是LDL-C的關系，本研究發現此位點與LDL-C水平之間并無相關性，共同印證了此位點可能具有種族遺傳異質性。

在對一些人種的大量研究中發現許多SNP位點與血漿中LDL-C水平和冠心病均相關。對這些相關SNP的研究統計發現使LDL-C升高的等位基因仍然會增加使用降脂藥物治療患者患心肌梗死的風險，而對于未使用降脂藥物的患者此風險并未增加[14]。所以對于有這些等位基因的患者，降脂并不是唯一降低他們患心血管疾病的方法。同時也說明這些位點對于心血管疾病的發生機制可能還涉及與血脂無關的因素。一篇關于中國漢族人群中rs1122608基因對于前mRNA剪接因子SFRS3表達調節的研究發現，其等位基因T顯示出與總膽固醇水平降低有明顯相關性，而它也能上調SFRS3編碼的一個mRNA剪接子的表達水平，但是與BRG1/SMARCA4 或 LDLR的表達無明顯相關性[15]。本文中各等位基因亞群與各血脂指標的關系均未發現明顯相關性。一方面可能由于本研究樣本例數偏少，而另一方面，該文提出SFSR3表達水平的增加可能會降低白細胞介素-1β的表達和分泌，從而降低動脈粥樣硬化和中風的風險。這些表明rs1122608 基因對于心血管疾病的發生產生的作用可能并非直接影響了血脂相關基因的表達，而是通過上調SFRS3間接對其產生影響。

本研究發現在漢族人群中rs1122608(G/T)與高血脂之間無明顯相關性，可能具有種族特異性。

[1]Lloyd J,Robert JA,Todd MB,et al.Heart disease and stroke statistics-2010 update:a report from the American Heart Association[J].CircuLation,2010，121(7):206-215.

[2]Clarke R,Jonathan R,Sarah P,et al.Cholesterol fractions and apolipoproteins as risk factors for heart disease mortality in older men[J].Arch Intern Med,2007,167(13):1373-1378.

[3]Teslovich TM,Musunuru K,Smith AV,et al.Biological,clinical and popuLation relevance of 95 loci for blood lipids[J].Nature,2010,466(7307):707-713.

[4]Kathiresan S,Willer CJ,Peloso GM,et al.Common variants at 30 loci contribute to polygenic dyslipidemia[J].Nat Genet,2009,41(1):56-65.

[5]Knouff CW,Waterworth DM,Walker MC,et al.Genome-wide association of early-onset myocardial infarction with single nucleotide polymorphisms and copy number variants[J].Nat Genet,2009,41(3):334-341.

[6]李蕾.rs1122608、rs11206510和rs1746048多態性與漢族人心肌梗死和腦梗死的關聯研究[D].云南：云南大學,2010.

[7]中國成人血脂異常防治指南制訂聯合委員會.2007年中國成人血脂異常防治指南[J].中華心血管病雜志，2007，5(35):238-240.

[8]Roberts R,Stewart AF.Genes and coronary artery disease:where are we?[J].J Am Coll Cardiol,2012,60(18):1715-1721.

[9]周莉.中國漢族人群血脂水平及冠心病的遺傳易感性研究[D].武漢：華中科技大學,2011.

[10]Catia A,Alex SN,Zhu YW,et al.Tissue-specific SMARCA4 binding at active and repressed reguLatory elements during embryogenesis[J].Genome Res,2014,24(6):920-929.

[11]Wang Y,Wang L,Liu X,et al.Genetic variants associated with myocardial infarction and the risk factors in Chinese popuLation[J].Plos One,2014,279(1):86332.

[12]Jamaldini SH,Babanejad M,Mozaffari R,et al.Association of polymorphisms at LDLR locus with coronary artery disease independently from lipid profile[J].Acta Med Iran,2014，52(5):352-359.

[13]Zhang L,Fang Y,Liu P,et al.Association between PCSK9 and LDLR gene polymorphisms with coronary heart disease:Case-control study and meta-analysis[J].Clin Biochem,2013,46(9):727-732.

[14]Woestijne AP,Graaf Y,Bakker PI,et al.LDL-C-linked SNPs are associated with LDL-C and myocardial infarction despite lipid-lowering therapy in patients with established vascular disease[J].Eur J Clin Invest,2014,44(2):184-191.

[15]Xiong X,Xu C,Zhang Y,et al.BRG1 variant rs1122608 on chromosome 19p13.2 confers protection against stroke and reguLates expression of pre-mRNA-splicing factor SFRS3[J].Hum Genet，2014,133(5):499-508.

Association study between rs1122608 and lipid levels in Chinese Han population*

CHENGXiao-huan,LIZu-hua，ZHENGFang△

(CenterforGeneDiagnosis,DepartmentofClinicalLaboratory,ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan,Hubei430071,China)

Objective To study the association of rs1122608 single nucleotide polymorphism (SNP) and serum lipid levels in the Han population.Methods A total of 204 hyperlipidemia cases as the hyperlipidemia group and 187 healthy people as the healthy control group were recruited for the study.Serum lipid levels were detected by automatic biochemical analyzers.The rs1122608 polymorphism was determined by polymerase chain reaction (PCR) and high-resolution melting (HRM).The genotype and allele frequency distributions were compared between the hyperlipidemia group and the healthy control group.Serum lipid levels among different genotype subgroups in the hyperlipidemia group and the healthy control were compared also.Results The differences in the genotypic and allelic frequencies between the the hyperlipidemia group and the healthy control had no statistical significance (P>0.05).And there were no significant differences in TG,TC,HDL-C and LDL-C levels among different genotype subgroups in the hyperlipidemia group and the healthy control.Conclusion The rs1122608 polymorphism is not associated with lipid levels in Chinese Han population.

hyperlipidemia; single nucleotide polymorphism; high-resolution melting

武漢大學中南醫院院內基金(201105)。

程小歡，女，碩士，主管技師，主要從事心血管疾病的分子生物學檢驗研究。△

，E-mail：zhengfang@whu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.14.016

A

1672-9455(2015)14-2016-03

2015-02-28

2015-04-15)