雞馬立克氏病的診斷

石麗娟

摘要：雞馬立克氏病是由皰疹病毒引起的雞的一種淋巴細胞增生性、高度接觸性傳染病。利用解剖學、組織學、血清學和病毒學檢查對疑似雞馬立克氏病進行了診斷。

關鍵詞：雞馬立克氏病；診斷；防治

中圖分類號：S858.31 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X（2014）12-0014-03

馬立克氏病（Mareks disease，MD）是由馬立克氏病皰疹病毒引起的傳染性腫瘤性疾病，是最常見的一種雞淋巴組織增生性傳染病[1]。以外周神經包括虹膜、皮膚在內的各種器官和組織的單核性細胞浸潤為特征[2]。馬立克氏病對1日齡雛雞最易感染，2～18周齡雞均可發病。母雞比公雞易感性高。潛伏期常為3～4周，一般在50日齡以后出現癥狀，70日齡后陸續出現死亡，90日齡以后達到高峰，偶見3～4周齡的幼齡雞和60周齡的老齡雞發病。該病的發病率變化很大，一般肉雞為20%～30%，個別達60%；產蛋雞為10%～15%，嚴重達50%，死亡率與之相當。MD 存在于世界上所有養禽國家和地區，隨著養雞業的集約化程度的提高，其危害增大，受害雞群的損失可高達50%以上。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料 丹東市某地區某農戶送檢的病死雞30只，雛雞20只。

1.1.2 試劑 MD陽性血清、MD沉淀抗原、甲醛、乙醇（95%）、二甲苯、石蠟、甘油、蘇木素、鉀明礬、曙紅、NACL。

（1）陽性血清的制備：用已知的標準MD抗原與雞群中慢性病雞或康復雞的血清做瓊脂凝膠試驗，如出現清晰的沉淀線，則為MD陽性血清。采血分離血清加0.01%硫柳汞防腐，凍結保存備用。

（2）瓊脂平板制備：用含8%NaCL的硝酸鹽緩沖液（0.01mol/L，pH7.4）配制1%瓊脂糖，水浴加熱使瓊脂糖充分溶解，多層紗布過濾，將無菌平皿（直徑9 cm）置水平臺上，每個平皿倒入融化的瓊脂糖約15～20 mL[13]。使其厚度為2.5～3.0 mm。注意傾倒時勿產生氣泡，置4 ℃冰箱中保存備用。

在已制備的瓊脂板上，用打孔器按六角形圖案打孔，或用梅花形打孔器。中央打1個孔，孔徑4 mm，周圍打6個孔，孔徑3 mm，中央孔與周圍孔孔距為3 mm。將孔中的瓊脂用8號針頭斜面向上從右側邊緣插入，輕輕向左側方向挑出，勿損壞孔的邊緣，避免瓊脂層脫離平皿底部[14]。將平皿底部置80～90 ℃水浴中旋轉數秒鐘，或放在酒精燈火焰上緩緩加熱，微微燙即可。使孔底邊緣的瓊脂少許熔化以封底，以免加樣后液體從孔底滲漏。

1.1.3 儀器 顯微鏡、電熱恒溫培養箱（DHG-9053A型）、切片機、水浴鍋、座式自動電熱壓力蒸汽滅菌器、微量移液器、電爐、平皿、架盤藥物天平、砝碼、藥匙、量筒、燒杯、玻璃棒、紗布、漏斗、毛刷、剪子、手術刀、鑷子、載玻片、蓋玻片、木塊、廢液缸、酒精燈、濾紙、樹膠、新鮮蛋白、1 mL注射器、三分試管、加樣器、加樣滴頭、打孔器、瓊脂擴散平板等。

1.2 試驗方法

1.2.1 病死雞剖檢 將送檢的病例進行尸體剖檢，外部檢查之后用清水將禽體羽毛浸濕，切開大腿與腹側連接的皮膚，用力將兩大腿向外翻壓直到兩髖關節脫臼，使禽體背臥位平躺。在泄殖孔前的皮膚作一條橫切線，由此切線中部沿腹中線由后向前剪開皮膚，直到喙角，使腹部和胸部皮膚分離，進行臨床剖檢診斷。在臨床癥狀觀察、尸體剖檢的基礎上，從待檢雞的背部、翅尖、尾尖拔取含有羽髓豐富的羽毛供實驗室檢驗，以尋求確診。

1.2.2 病理組織切片

（1）切片制備。固定：用福爾馬林固定24 h。浸洗：用自來水沖洗組織塊24 h。脫水：洗滌后組織塊在70%、80%、90%、95%、100%（A），100%（B）乙醇中每級各停留2 h。透明：把組織塊放到二甲苯中至透明。浸蠟與包埋：將已透明的材料放入石蠟中，使材料中充滿石蠟；將包埋用的石蠟倒入小瓷槽內，用鑷子將浸過石蠟的材料放入倒有石蠟的小瓷槽內，當表面冷卻后，將小瓷槽輕快地放入冷水中，使蠟塊浮起后，即可收取，待切。切片：首先將包埋于同一蠟塊中的材料分開，使每一小蠟塊中只含有一塊材料；然后，將蠟塊修成四方形或長方形，并粘在木塊上；這時將蠟塊固定在切片機上進行切片，厚度在5 μm之間。展片與貼片：首先將蠟帶斬為單片，再將單個蠟片放于40 ℃的溫水中，使其展開，展平，再取一張中央涂有甘油-蛋白膠的載片伸入溫水中，將蠟片撈于載片中央，傾去多余的水份后置于干燥箱中，60 ℃條件下烘干。染色、脫水、透明：把浸于70%乙醇的組織塊加入倍量蒸餾水，兩次稀釋至蒸餾水約2 h，投入碘酸鈉蘇木精，蒸餾水分色10 h，自來水藍化3 d，蒸餾水洗1 min，70%、80%、90%乙醇逐級脫水各1 h，伊紅溶液染色2 d，90%乙醇（A）、（B）脫水與分色各1 h，100%乙醇（A）、（B）各脫水1 h，二甲苯（A）、（B）透明各1 h。封存：將已經透明的切片從二甲苯（B）中取出，滴加樹膠，蓋上蓋玻片即可，拷干后制成永久性標本。

（2）注意事項。組織固定：用于組織固定的材料必須新鮮，采集和分割后要立刻固定，不得延誤；固定材料體積的大小，以不超過直徑5 mm為準，材料與固定液的比例，以1：20為準；所用固定液以新配的為好，并放置在陰涼處，不要在日光下直曬；材料固定完畢后，必須在容器外貼上標簽，以防止相互混淆。組織脫水：組織脫水是在低濃度乙醇中，每級停留不宜太長，否則易使組織變軟，助長材料的解體；在高濃度乙醇中，每級停留時間也不宜太長，否則可使組織收縮變脆，影響切片；脫水應徹底干凈，否則與二甲苯混合后，將呈乳白色渾濁，雖然可以倒回重脫，但效果不好；如需過夜，應停留在70%乙醇中。組織塊透明：組織塊透明時要注意二甲苯極易揮發，故在切片透明之后，從染色缸中取出封藏，手續要敏捷，不宜久置，否則待二甲苯揮發干凈后，組織就會變硬發白，即使再加樹膠封藏，由于樹膠不能浸入組織，封后也無用處；二甲苯極易吸收空氣中的水分，故在濕度大的天氣，貯有二甲苯的染色缸的蓋子周緣可涂少許凡士林，以防止水分的滲入。在封片時也不宜將口鼻過分靠近切片，以免水氣侵入，出現白色云霧狀；二甲苯必須保持無水無酸。若用1～2滴石蠟油滴入其中，立即出現云霧狀，即表示其中已含有水分，不能再用。石蠟切片制作：檢驗過程中，石蠟切片制作出現了材料裂隙、破碎的情況，請做類似試驗時借鑒。

通過流行病學、臨床癥狀、剖檢變化、組織學觀察可以作出診斷，進一步確診還需進行瓊脂擴散沉淀實驗、病毒分離等方法。

1.2.3 血清學診斷（瓊脂擴散試驗）

（1）用MD抗原檢測被檢雞血清樣本，用滴管在中央孔加入MD抗原，標準陽性血清分別加入外周1、4孔。被檢雞血清按順序分別加入4個外周孔中，每一個被檢樣用1個滴頭。加樣完畢，蓋上平皿，做好標記、編號，放入帶蓋濕盒中，置37 ℃溫箱內24～48 h，觀察并做詳細記錄。

（2）用MD陽性血清檢測雞的羽髓，選拔被檢雞含羽髓的翅羽或身體其他部位的大羽（或新生羽）數根，將含有羽髓的羽根按雞的編號分別集于三分管內，每管加2～3滴蒸餾水，用玻璃棒將羽根壓集于管底，以適當的壓力轉動玻璃棒，擠壓出羽髓后傾斜試管，用毛細管順次加到外周受檢孔中（2、3、5、6孔）。中心孔加入MD陽性血清，外周1、4孔加入標準抗原。加樣完畢，蓋上平皿，做好標記、編號，放入帶蓋濕盒中，置37 ℃溫箱內24～48 h，觀察并做詳細記錄。

注意事項：應多拔幾根新羽來檢查；加樣時，以把孔加滿為度，切忌樣品溢出，影響判定結果；與鄰接孔連片時應作廢處理；MD陽性血清避免反復凍融，以防降低效價而影響檢出結果；在瓊脂擴散試驗時，還要注意羽囊同邊緣孔緊密吻合，防止羽囊徑小，邊緣孔大，抗原擴散不充分，降低查檢率。

判定標準：標準抗原與標準陽性血清兩孔間形成清晰的白色沉淀線。被檢材料孔與標準試劑孔間出現明顯的沉淀線，或標準陽性試劑間的沉淀線末端向被檢材料一側曲，判為陽性。有的被檢材料可能出現1條以上的沉淀線，仍判為陽性。無沉淀線則為陰性。

1.2.4 病毒學診斷（病毒分離） 分離病毒的材料，采用病雞的抗凝血，由于MDV具有高度的細胞結合性，在分離材料的處理過程中，除保持無菌條件外，還必須保持分離細胞的生理活性。

（1）雞胚接種法。試驗組：將0.1 mL的病料分別接種于10只4～5日齡雞胚卵黃囊內，分別于接種后4～6 d和10～11 d觀察絨毛尿囊膜上是否產生典型的皰疹病毒痘斑。對照組：將0.1 mL的抗凝劑分別接種于10只4～5日齡雞胚卵黃囊內，分別于接種后4～6 d和10～11 d觀察，與試驗組進行對照。

（2）雛雞接種法。試驗組：選擇1日齡或1周齡的易感雞10只，將病料如病雞的抗凝血0.5 mL經腹腔接種，然后嚴格隔離飼養觀察，接種后18～21 d，觀察是否產生雞馬立克氏病的特征性病理變化。對照組：選用抗凝劑0.5 mL經腹腔接種，同時隔離飼養觀察，與試驗組進行對照。

2 結果與分析

2.1 病理剖檢結果

在送檢的30只病死雞中，22只出現坐骨神經、迷走神經等單側性神經腫大而變粗，呈黃白色水腫樣變化；21只出現肝臟腫大、質脆，表面觀察到大小不等的白色結節；17只出現心外膜可見綠豆至黃豆大小的白色結節，形狀呈球形、橢園形或不規則形，結節突出于心臟表面致使心外膜凹凸不平；15只出現脾臟腫大，包膜緊張，切面膨隆外翻；18只出現腎臟腫大，前腎隆起凸入腹腔，可見大小不等的灰白色結節；22只腺胃黏膜乳頭腫脹，乳頭之間可見出血斑；23只肌胃角質膜下觀察到線狀出血斑；16只十二指腸黏膜充血或出血病變；20只盲腸扁桃體腫脹、出血；22只泄殖腔黏膜線狀出血病變；20只法氏囊出現萎縮。4只無明顯剖檢病理變化。

2.2 病理組織切片結果

2.2.1.心臟 心肌纖維顆粒變性、水泡變性。在血管周圍、肌纖維間、心外膜下有淋巴細胞呈浸潤性增生。肌纖維脂肪變性，局部蠟樣壞死。

2.2.2 脾臟 鞘動脈周圍、淋巴小結出現大量淋巴細胞、網狀細胞。淋巴細胞核碎裂、邊集，并見核分裂相。

2.2.3 肝臟 肝細胞顆粒變性、水泡變性、部分壞死。竇周隙狹窄，散在少量的紅細胞和淋巴細胞。中、小淋巴細胞、網狀細胞在靜脈周圍浸潤。在肝小葉內局灶性增生。增生灶內有呈空泡狀的原始網狀細胞和核邊集的凋亡淋巴細胞。肝細胞壞死處有淋巴細胞集聚。

2.2.4 腎臟 腎小球體積增大。腎小囊腔狹窄。并有血紅蛋白樣物質。腎小囊壁上皮細胞腫脹。局部腎小球萎縮，出現代償性增大。腎小管上皮細胞從顆粒變性、水泡變性到細胞壞死、胞膜破裂，整個腎小管呈均質紅染。腎小管內有血紅蛋白樣物質，呈尿管型。

2.2.5 坐骨神經 神經纖維間水腫液內散在中小淋巴細胞及漿細胞。局部灶性增生。

2.2.6 卵巢 皮質和髓質見有結節性或彌漫性網狀細胞、淋巴細胞集聚。淋巴細胞核顯分裂相，局灶性增生細胞排列呈渦漩狀。部分卵泡全部被多形態淋巴細胞所代替。

2.2.7 腺胃 腺小管腺細胞開始呈顆粒變性、水泡變性，逐漸壞死，腺小管內散在流失的胞漿。淋巴細胞和網狀細胞在腺小管間、肌層間、漿膜下浸潤和增生。

2.2.8 十二指腸 肌層肌細胞和腸絨毛上皮細胞變性、壞死。漿膜、漿膜下肌層、腸腺間和絨毛固有層出現不同程度的大中小淋巴細胞浸潤和增生。腸腺間有網狀細胞增生。

2.2.9 肺 血管內、外散在淋巴細胞。血管周圍肺小葉間隔有少量的淋巴細胞浸潤，局部肺泡間隔及支氣管周圍充滿大量的大中小淋巴細胞、少量的網狀細胞。肺小葉內充滿淋巴細胞、紅細胞，局部實質內全被腫瘤細胞代替。

2.3 血清學診斷的結果

30份病料中，26份陽性，4份陰性。21份產生清晰可見的灰白色沉淀為陽性，5份產生一條以上的沉淀線，但仍屬于陽性，4份無沉淀線則為陰性。

2.4 病毒分離的結果

通過試驗組與對照組的比較，試驗組雛雞接種后可見肝、脾表面和切面均可見白色結節狀腫瘤，腎、卵巢褪色、腫大等典型雞馬立克氏病的特征性病理變化。

試驗組雞胚接種，在絨毛尿囊膜上可出現MDV引起典型皰疹病毒痘斑。在檢查痘斑時應注意區別其他病原引起的類似痘斑。

通過產生的這種典型皰疹病毒痘斑可對雞馬立克氏病進行確診。

3 防治措施

3.1 加強飼養管理和衛生管理

加強飼養管理，改善雞群的生活條件，增強雞體的抵抗力，對預防該病有很大的作用。飼養管理不善、環境條件差或某些傳染病如球蟲病等常是重要的誘發因素。定期搞好雞舍尤其是出雛室和育雛舍的徹底消毒，防止雛雞的早期感染是非常重要的，否則即使出殼后即刻免疫有效疫苗，也難防止發病。

3.2 疫苗接種

目前國內使用的疫苗有多種。按產地可分為進口疫苗和國內生產的疫苗。按血清型可分為三種，血清1型疫苗：主要是減弱弱毒力株CV1-988、814疫苗；血清2型疫苗：主要有SB-1、301B/1、Z4株；血清3型疫苗：即火雞皰疹病毒HVT-FC126疫苗。按疫苗所有毒株種類，可分為單價苗、二價苗和三價苗等。自20世紀80年代開始，由于出現了超強毒，單價苗免疫失敗屢屢發生，因此有些學者提出多價苗戰略，并先后研制出多價苗，二價或三價苗等。

4 小結

本試驗對30只病死雞進行剖檢診斷，病理組織切片觀察，瓊脂擴散試驗和病毒分離試驗進行診斷。病理剖檢見坐骨神經、迷走神經單側性腫大以及肝臟腫大、質脆等；光鏡下，肝組織中集聚大量淋巴樣細胞，心肌纖維間彌散大量多形性淋巴細胞；瓊脂擴散試驗結果為：26份陽性，4份陰性。將病料接種雛雞，雛雞均出現典型的雞馬立克氏病病理變化；病料雞胚接種見絨毛尿囊膜上出現明顯皰疹病毒痘斑；確診30只疑似病例中，有26只患有雞馬立克氏病，4只無明顯馬立克氏病的明顯癥狀。目前對該病尚無特效療法，其防治關鍵是疫苗接種并同時做好綜合防治。

參考文獻：

[1] 金春富，趙福奎，吳常義.雞馬立克氏病的診斷及綜合防制[J].畜牧獸醫科技息，2010，（1）：79.

[2] 霍擊斯塔.禽病學（上冊）[M].第2版，胡祥壁譯.北京：中國農業大學出版社，1983.