酒精性肝纖維化中主要信號轉導通路的研究

姜艷紅 張維東

酒精性肝?。ˋLD）是由于長期大量飲酒導致的肝臟疾病。初期通常表現(xiàn)為脂肪肝，進而可進展為酒精性肝炎、酒精性肝纖維化（ALF）、酒精性肝硬化甚至可引起肝功能衰竭。ALD的進展過程中，乙醇在體內(nèi)代謝通過多個環(huán)節(jié)產(chǎn)生氧自由基（ROS），ROS作用于生物膜磷脂中的多聚不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化形成過氧化脂（LPO），LPO可通過誘導炎性細胞浸潤而誘導HSC活化增殖。乙醛是乙醇的中間代謝物，能觸發(fā)多種復雜的反應，可以使細胞基質(zhì)分泌增多并激活HSC，從而導致ALF的發(fā)生。因ALF早期具有可逆轉的特點，所以對發(fā)生機制的深入研究一直是近年來的熱點。

研究表明，HSC的活化和增殖在肝纖維化的發(fā)生過程中起著關鍵作用［1］，活化的HSC表達多種細胞外信號通路蛋白，產(chǎn)生以膠原為主的細胞外基質(zhì)（ECM）和細胞因子。HSC活化的標志物包括平滑肌肌動蛋白-α（α-SMA）、原膠原Ⅰ、轉化生長因子-β1（TGF-β1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）和組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）等。經(jīng)過乙醛處理后，膠原蛋白Ⅰ的合成增加，而在HSC中其降解減少，在肝臟中的膠原蛋白和膠原蛋白基因產(chǎn)生高效表達。有研究表明，早期依賴乙醛的反應可引發(fā)后期的肝纖維化［2］。

了解參與HSC活化增殖凋亡的相關細胞因子介導的信號轉導通路可為逆轉ALF提供有效的靶向。本文簡要綜述了ALF主要的細胞信號轉導通路。

1 TGF-β／Smads信號轉導通路

TGF-β是一種參與細胞存活、增殖、分化、血管生成和傷口愈合應答的多效性細胞因子［3-4］。在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)有 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β1β2四個亞型。許多細胞表面都有TGF-β受體（TGF-βR）表達，其具有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三種形式。TGF-βRⅠ、Ⅱ型均為糖蛋白，它們與 TGF-β1的親和力是與TGF-β2的親和力的10～80倍，Ⅲ型受體則是一種與 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三者的親和力相近的蛋白聚糖，是TGF-β主要的受體，可能在TGF-β發(fā)揮生物學功能中起著重要作用。TGF-βRⅢ的主要配體是 TGF-β1和 TGF-β3。

Smads蛋白家族在將TGF-β信號從細胞表面受體轉導至細胞核的過程中起著主要作用，在保守的結構域MH1和MH2之間有中間連接區(qū)域。每個Smad蛋白介導不同的TGF-β家族成員的信號轉導。Smad2和Smad3參與TGF-β活化素信號途徑，Smad4的MH1結構域具有轉錄激活和定位功能，而Smad6和Smad7是TGF-β／Smads信號通路的抑制分子。在Smad蛋白依賴的信號中，TGF-β1和Ras相關激酶使Smad2和Smad3差異磷酸化，從而建立羧基末端（C）、鏈接器（L）或雙重（L／C）磷酸化異構體，磷酸化的Smad2、Smad3與Smad4基因移位到細胞核內(nèi)，激活或抑制它們所調(diào)節(jié)的靶基因的轉錄。

研究表明，細胞凋亡、免疫清除、表型逆轉和細胞衰老參與清除活化的HSC或抑制HSC激活，可以逆轉肝纖維化［5］。慢性肝病中TGF-β通過炎性反應促進纖維發(fā)生，是較有力的促進因素［6-7］。HSC的激活和纖維化的進展與 TGF-β1、TGF-βRⅡ、Smad3a、Smad3b等表達上調(diào)有關［8］。在小鼠和大鼠的HSC中采用細胞增殖和凋亡檢測以及RT-PCR、蛋白質(zhì)印跡法分析、免疫組化染色、流式細胞技術等方法，結果發(fā)現(xiàn)TGF-β1上調(diào)血小板衍生生長因子-β（PDGF-β）受體mRNA的表達并明顯誘導HSC增殖，且依賴TGF-β1的HSC增殖是由過氧化氫酶抑制的過氧化氫作用的，即PDGF-β受體通過激活PI3K／AKT／P70（S6K）信號通路影響TGF-β1的作用并通過 ROS介導［9］。Tang等［10］體外實驗發(fā)現(xiàn)，鱉甲提取肽（CTEP）可影響TGF-β1誘導的HSC，應用MTS試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗和免疫印跡法可知，Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和TIMP-1的含量顯著被抑制，經(jīng)CTEP處理后Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、p-Smad3、TIMP-1和α-SMA的蛋白顯著降低，而Smad3蛋白的差異沒有統(tǒng)計學意義。提示通過TGF-β1／Smads通路以及消除ECM能有效抑制培養(yǎng)的HSC-T6細胞的活化和增殖。在肝纖維化中TGF-β／Smads信號通路的作用機制已較明確，而此通路在ALF中同樣發(fā)揮著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)乙醛可以使HSC中的TGF-β信號通路激活，TGF-β1抑制肝實質(zhì)細胞增殖，促進Ⅰ型膠原蛋白及纖維黏連素增加，導致HSC增殖并轉分化，而TGF-β信號可以通過下調(diào)乙醇脫氫酶1增加肝臟脂質(zhì)的堆積［11］。也有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可以作用于ROS生成和鈣內(nèi)流，而這兩者是調(diào)節(jié)HSC的活化劑。TGF-β1介導氧化應激引起HSC的轉分化，為ECM沉積和疤痕收縮做好準備，致使ECM和Ⅰ型膠原蛋白產(chǎn)生。從桑黃菌絲體中分離出的一種視黃酸衍生物可下調(diào)TGF-β1／PDGF刺激的HSCT6細胞中ROS生成和鈣內(nèi)流，逆轉早期肝纖維化［12-13］。Smad7是TGF-β信號通路的細胞內(nèi)的負調(diào)節(jié)物，在乙醇引起的肝損傷過程中，調(diào)控脂肪生成和炎性反應發(fā)生的關鍵基因表達上調(diào)，肌成纖維細胞中TGF-β能傳遞引起纖維化的pSmad2 L／C與促有絲分裂的pSmad3 L信號，因為Smad7不能被pSmad3 L信號途徑誘導，Smad7缺失加劇，缺乏Smad7的肝細胞里TGF-β誘導的上皮間質(zhì)轉化加快且乙醇脫氫酶表達顯著降低，缺少Smad7可能導致 ALF加速［14-15］。

2 Wnt／β-catenin信號轉導通路

Wnt是一類通過自分泌或旁分泌發(fā)揮作用的糖蛋白，目前研究發(fā)現(xiàn)主要有 Wnt1、Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a等19種蛋白。其信號通路的核心蛋白為一種多功能的蛋白質(zhì)β-連環(huán)蛋白（β-catenin），在細胞連接處與鈣黏素相互作用而形成粘合帶。游離的β-catenin能進入細胞核參與基因表達。β-catenin降解復合體主要由結腸腺瘤性息肉?。ˋPC）基因蛋白、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、支架蛋白Axin組成。Wnt信號通路包括Wnt經(jīng)典信號通路和Wnt非經(jīng)典信號通路。經(jīng)典途徑受到激活后，胞外的 Wnt蛋白與其細胞表面受體Frizzled以及LRP跨膜受體結合成復合體，通過活化的蓬亂蛋白（Disheveled，又稱Dsh或Dvl）激活下游因子GSK-3β結合蛋白（GBP），GBP識別并抑制GSK-3β的活性，從而影響β-catenin絲氨酸及蘇氨酸的磷酸化及降解，阻止β-catenin降解復合體的形成，導致β-catenin在胞漿內(nèi)蓄積并進入核內(nèi)，與轉錄因子LEF／TCF結合形成轉錄復合物，激活某些特定基因的表達［16-18］。

Wnt／β-catenin信號通路與TGF-β信號通路、miRNA之間在參與肺纖維化、肝纖維化、皮膚纖維化和腎纖維化等各器官相關的致病作用中存在著信號串話［19］。激活HSC后，Wnt信號途徑中某些元素被上調(diào)［20］。但是此通路在ALF中的作用機制目前還未被完全闡明。有研究發(fā)現(xiàn)，在ALF中利用肌成纖維細胞基于Cre-loxP的遺傳標志物，在肝纖維化復原過程中，半數(shù)肌成纖維細胞逃避凋亡，下調(diào)形成纖維化的基因，并獲得一個類似的表型，但不同于靜止態(tài)的HSC，在促纖維化刺激中能更迅速地重新活化成肌纖維母細胞，并且強有力地促進肝纖維化的形成［21］?；罨腍SC內(nèi)β-catenin的表達水平是靜止態(tài)HSC的5～7倍，當β-catenin的作用受到阻斷時HSC的活性也被抑制，而乙醛刺激大鼠的HSC使β-catenin表達明顯增加。Sept4蛋白只在靜止態(tài)的HSC內(nèi)表達，HSC通過損失Sept4蛋白后促纖維化轉化，在某種程度上由于DKK2和同系物的表達減少，解除了經(jīng)典Wnt通路的抑制，而DKK2的單苷酸多態(tài)性（SNP）與乙醇損害相關［22-23］。在 體 外 培 養(yǎng) 的 HSC 中，TGF-β1 通 過（ERK1／2）／GSK-3軸促進β-catenin的表達并增加β-catenin的蛋白穩(wěn)定性，經(jīng)由β-catenin通路下調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPARγ）的表達活性而達到增加α1膠原蛋白的水平［24］。在大鼠的酒精性肝病模型中，研究發(fā)現(xiàn)增加肝細胞的增殖，視黃醇及視黃酸存儲耗竭，β-catenin和磷酸化的GSK-3β胞質(zhì)和核表達增加，Wnt7a mRNA和幾種β-catenin的目標蛋白包括谷氨酰胺合成酶、細胞周期蛋白D1、Wnt1誘導的信號通路蛋白及基質(zhì)金屬蛋白酶7的表達顯著上調(diào)。以上研究表明在乙醇引起的慢性肝臟疾病中，Wnt／β-catenin信號轉導途徑可被激活［25］。但也有研究發(fā)現(xiàn)，乙醛引起的α2Ⅰ型膠原蛋白mRNA和Wnt蛋白的表達水平是獨立的，因為DKK1沒有阻止這些誘導。β-catenin的小抑制RNA顯著下調(diào)新鮮分離的HSC中致纖維化基因的表達，在核氧化還原蛋白過度表達的HSC中β-catenin的核移位受抑制，乙醛增加磷酸化的GSK-3β蛋白并刺激β-catenin的核移位，還增加了細胞內(nèi)的活性氧水平。穩(wěn)定的β-catenin移位至細胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)致纖維發(fā)生的通路基因［26］。因此，需深入了解 Wnt／β-catenin信號通路的作用機制，為有效逆轉ALF提供治療靶點。

3 NF-κB信號轉導通路

核轉 錄 因 子-κB（NF-κB）家 族 由 NF-κB1、NF-κB2、cRel、Rel-A和 Rel-B組成。這些蛋白質(zhì)任意兩者之間可以形成同源或異源二聚體，二聚化后形成有活性的NF-κB，但其中Rel-B只能與NF-κB1或者NF-κB2有效結合。它們都有一個Rel同源結構域，是由300個氨基酸組成的氨基末端。IκB是NF-κB的強抑制蛋白，有IκBα、IκBβ、IκBγ、IκBδ、IκBε五個抑制分子。它們都有兩個N末端絲氨酸殘基、多個與降解有關的C端脯-谷-絲-蘇序列和錨蛋白重復序列，Rel同源區(qū)調(diào)控錨蛋白重復序列與NF-κB的相互作用。在未受刺激的細胞中NF-κB二聚體通過與細胞質(zhì)中IκBα、IκBβ、IκBε三個抑制因子其中之一結合而呈現(xiàn)無活性狀態(tài)。各種信號通過使IκB蛋白磷酸化、泛素化，進而被蛋白酶體降解的方式來活化NF-κB，活化的NF-κB進入細胞核內(nèi)與DNA結合來誘導靶基因的轉錄。NF-κB在炎性反應、免疫應答、細胞增殖、細胞凋亡和腫瘤等重要生理病理過程中發(fā)揮著重要作用。NF-κB能夠被脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物、內(nèi)毒素等激活，調(diào)節(jié)包括結締組織生長因子（CTGF）等多種基因的表達，從而呈現(xiàn)NF-κB的核轉位活性，促進成纖維細胞增生分化，參與肝纖維化的形成。

許多細胞因子在基因水平上都受到NF-κB的調(diào)控，在腫瘤壞死因子（TNF）和白細胞介素（IL）等細胞因子的啟動子上都有NF-κB的結合位點。在病毒性肝炎、酒精性肝病、肝纖維化、肝臟腫瘤等多種肝臟損傷及疾病中都伴有NF-κB活性的改變。當細胞受到氧化應激、免疫刺激劑、細菌病毒、乙醇、氧自由基和細胞因子等刺激時，被激活的NF-κB和磷酸化的IκB-α含量增高，通過影響炎性因子TNF-α、IL-6的表達和分泌啟動免疫炎性反應等多種損傷基因的轉錄，增強翻譯過程，參與肝損傷的發(fā)生發(fā)展。NF-κB2可以促進ECM增多并積聚，導致HSC活化，實驗證明NF-κB活化和CTGF與ALF的嚴重程度有密切關系。孫屹峰等［27］用參芪扶正注射液治療乙醇灌胃誘導的肝纖維化大鼠，發(fā)現(xiàn)其能顯著降低肝纖維化大鼠NF-κB及CTGF mRNA的表達，降低肝纖維化的進展程度。提示抑制NF-κB的活化，下調(diào)CTGF的表達可以防治并逆轉肝纖維化。紫鉚通過NF-κB、JNK、p38促分裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）通路介導乙醇誘導的HSC的細胞內(nèi)信號，可抑制由乙醇或乙醛誘導的ROS產(chǎn)生和HSC的遷移，從而減少乙醇的毒性，下調(diào)TGF-β、TIMP-1和TIMP-2的表達，降低 MMP-2的活性，增加MMP-13的活性，抑制p38 MAPK和JNK信號轉導途徑的激活，并顯著抑制NF-κB的抑制劑IκB和Smad3的磷酸化［28］。小鼠酒精性肝細胞損傷過程中，NF-κB通路被激活，且NF-κB、炎性因子、趨化因子等多種因子表達增高，NF-κB的激活促進HSC的增殖，減少HSC的凋亡，并且可以促進膠原蛋白的生成，引起肝組織發(fā)生炎性反應、纖維化、壞死和凋亡［29］。而乙醛處理HSC后胞質(zhì)中IκB的含量顯著下降，乙醛可以使IκB降解，使其對NF-κB的抑制降低，促進 NF-κB的核轉移。但究竟是 HSC的活化影響了NF-κB，還是NF-κB的激活介導了HSC的活化，迄今為止還沒有相關文獻報道。

4 小結

綜上所述，HSC活化、增殖和凋亡所涉及的調(diào)節(jié)信號轉導網(wǎng)絡系統(tǒng)繁多，TGF-β／Smads通路、Wnt／β-catenin通路和NF-κB通路彼此之間聯(lián)系錯綜復雜，共同介導著ALF的發(fā)生發(fā)展，了解掌握彼此的關聯(lián)對逆轉纖維化有著至關重要的作用。以酒精性肝病傳統(tǒng)治療為基礎，通過干預各信號介導途徑，建立干預HSC激活凋亡的分子治療靶點可以有效達到治療目的。然而，各個通路的作用機制及其相互聯(lián)系目前尚不明確，需要更深入的研究剖析在HSC中的多條信號通路發(fā)揮的作用和聯(lián)系，才能有望徹底逆轉肝纖維化。

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