間充質干細胞治療晚期脂肪性肝病的研究進展

陳 怡

肝病至今仍是五大致死性疾病之一，其中脂肪性肝病現已取代病毒性肝病成為全球第一大類肝病，由脂肪性肝病發展為肝硬化或重癥肝病的患者不斷增多。無論急性或慢性脂肪性肝病、酒精性或非酒精性脂肪性肝病、營養不良性或營養過剩性脂肪性肝病，均可引起大量肝細胞壞死，出現肝纖維化，最后導致不可逆的肝衰竭。而且脂肪性肝病早期多無臨床癥狀，易被忽視，晚期只能行肝移植。由于肝移植器官來源緊缺、有免疫排斥、費用昂貴且涉及倫理道德，故肝移植的普及是很困難的。利用間充質干細胞的高度增殖和分化潛能，細胞治療作為一種替代治療手段應運而生［1］。間充質干細胞來源廣泛，由于會導致腫瘤，其臨床應用受到嚴格限制［2］，外源性骨髓［3］、脂肪［4］、臍血［5］是常用的細胞治療用間充質干細胞的來源。本文著重闡述不同來源的間充質干細胞分化誘導成類肝細胞以治療晚期脂肪性肝病的研究進展。

1 間充質干細胞的來源和治療潛能

1.1 骨髓來源的間充質干細胞

骨髓來源的間充質干細胞（BMSC）來源于中胚層，具有自我復制、高度增殖和多向分化潛能，能夠被定向分化誘導為脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、韌帶和肌細胞譜系［6］。BMSC表面陽性表達CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、CD49e、CD51、CD54、CD59、CD71，不表達 CD34、CD45、CD14、CD79。有動物實驗發現，BMSC與表皮生長因子-4（EGF-4）、EGF-1α、肝細胞生長因子（HGF）及CK18等培養7 d后，BMSC表達了肝細胞核因子-3β（HNF-3β，FOXA2）、GATA4、CK19、轉甲狀腺素蛋白、AFP；14～28 d后，表達CK18、HNF-4、EGF-1α的細胞都表現出肝細胞的結構特征，能分泌尿素、白蛋白和細胞色素P450，產生低密度脂蛋白和儲存糖原［7］。因此，BMSC是一種理想的肝損傷和生物人工肝治療的干細胞來源。

1.2 脂肪來源的間充質干細胞

脂肪干細胞（ADSC）是來源于脂肪，具有自我更新和分化誘導能力，并呈現出干細胞特征的一群細胞。由于其來源易得，在體外有可能增殖成許多自體同源細胞，因此其用于細胞治療和組織工程受到廣泛關注。ADSC與BMSC的表面標志物表達相同、增殖潛能相似并可能前者更好［8］。

1.3 臍血來源的間充質干細胞

臍血干細胞來源于臍血，其許多成分是多能干細胞，表面標志物表達與BMSC相同，能分化產生不同類型的細胞。此外，臍血干細胞也表達胚胎干細胞的表面標志物，如 Tra-1-60、Tra-1-81、SSEA-1、SSEA-4、OCT-4［9］。因其低水平表達人類白細胞抗原-ABC（HLA-ABC），不表達 HLA-DR，分泌的分子能誘導自然殺傷（NK）細胞，并能抑制T細胞分泌轉化生長因子-β（TGF-β）和干擾素-γ（IFN-γ）［10］，因此臍血干細胞能夠從內胚層、中胚層直到外胚層進行擴展。

臍血干細胞首先被從其他干細胞中分離鑒定出來，它們表達干細胞的受體CD44、CD105、CD90和CD73［11］，但不表達造血干細胞的標志物CD31、CD34、HLA-DR和CD45，而且它們能分化成心肌細胞、成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、胰島樣細胞和神經樣細胞。

有研究指出，肝外的間充質干細胞能夠采用2D或3D的肝細胞共培養方式，通過外援性生長因子的刺激誘導為肝細胞［12］。Zhang等［13］用兩步法將臍血干細胞誘導分化為肝細胞，采用的肝細胞生長因子包括HGF、成纖維細胞生長因子（bFGF）、地塞米松、胰島素等。

上述研究表明，在合適的外環境和條件下，間充質干細胞能夠分化為肝細胞，是晚期脂肪性肝病細胞治療和肝臟組織工程的有效來源，而不同來源的干細胞具有不同的功能［14］，在小鼠模型和人類的應用中都值得作進一步研究。

2 脂肪肝的肝損傷及間充質干細胞修復的機制

酒精性肝病和非酒精性肝病是根據每日飲酒量來劃分的［15］，最終的結果都是導致肝纖維化和肝損傷。在酒精性脂肪性肝病中，乙醇可使肝細胞發生很大的改變，包括質膜、線粒體和細胞核［16］。在質膜中，乙醇可增加膜的通透性，誘導膜缺陷發生，引起磷脂的數量增加，增加膜表面電荷密度和脂質過氧化產物；特別是最近鑒定出了包括annexin A3和annexin A6在內的5種蛋白可作為乙醇導致肝硬化的相關生物標志物。在高脂飲食小鼠模型中，高脂飲食可引起三酰甘油和膽固醇升高，導致血脂異常、脂質過氧化和肝星狀細胞的激活，最終導致肝脂肪變［17］。肝細胞的胰島素抵抗，更加速了炎性反應的進程。

研究表明，干細胞轉變為肝細胞主要是通過兩種可能的機制：轉移分化和細胞融合［18］。首先，在間充質干細胞被注射入肝臟后，發生同型轉變，表達類肝細胞的基因型，完成肝細胞類似的新陳代謝功能表達。但只有8%～23%的間充質干細胞實現了向肝細胞的定向分化［19］，其機制不明。其次，肝損傷與免疫細胞浸潤引起的持續性炎性反應有關［20］，而間充質干細胞有免疫誘導特性，能分泌抗炎因子，下調T細胞、B細胞及單核細胞浸潤［21］。再次，輸注間充質干細胞可降低血小板衍生因子-BB（PDGF-BB）、TGF-β1，出現膠原蛋白減少，表達基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）、MMP-13、MMP-14等，激活溶酶原激活因子，實現肝纖維化的逆轉［22］。最后，移植間充質干細胞可導致肝星狀細胞凋亡，并通過分泌肝損傷修復過程中的生長因子和細胞因子來促進肝細胞增殖，最終促進已纖維化的肝臟容量提升。

3 間充質干細胞修復肝臟的應用現狀

有關間充質干細胞治療晚期脂肪性肝病的研究不多。Kharaziha等［23］對包括酒精性肝病在內的8例終末期肝病患者進行間充質干細胞治療。先從患者髂嵴處抽取脂肪進行體外培養增殖自體間充質干細胞，再通過外周靜脈和門靜脈輸注3×108～5×108干細胞，分別于注射后第1、2、4、8及24周評估療效。結果顯示，患者對間充質干細胞移植耐受，MELD 評分指數從（17.9±5.6）下降到（10.7±6.3）（P＜0.05），凝血酶原復合物指數從（1.9±0.4）下降到（1.4±0.5）（P＜0.05），血清肌酸酐從（114±35）mmol／L下降到（80±18）mmol／L（P＜0.05），血清白蛋白從（30±5）g／L上升到（33±5）g／L，膽紅素從（46±29）mmol／L下降到（41±31）mmol／L，沒有任何不良反應發生。

用BMSC和ADSC治療非酒精性脂肪性肝病的具體操作方法已有報道［24］。Pelz等［25］對蛋氨酸／膽堿缺陷飲食誘導的非酒精性脂肪性肝病小鼠模型輸注干細胞，結果移植后短期和長期的療效觀察都顯示間充質干細胞能在肝內定居并表現出肝細胞功能。

在用間充質干細胞治療時，通常不需要考慮免疫配型、組織相容性抗原（MHC）的匹配和防止免疫拮抗反應等問題。由于間充質干細胞不含MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ及共刺激分子CD80、CD86和CD40，不會引起同型T細胞反應，間充質干細胞不是宿主免疫識別的對象［26］，因此其能免受宿主免疫細胞的攻擊。有研究報道小鼠經間充質干細胞治療后，抗炎因子白細胞介素-10（IL-10）、IL-15受體等上調，促炎因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6等下調［27］。

在骨髓、脂肪、臍血等來源的間充質干細胞注射入肝臟后，可通過血清膽紅素、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）水平對效果進行臨床評估［28］。Kuo等［29］的研究認為，經脾注射和經靜脈注射都有助于肝細胞增加及肝臟修復，但后者比前者更有效，受體的氧化應激反應減輕能促進肝損傷后肝細胞的復原，提示有旁分泌作用的影響。Adriana等［28］的研究分別將BMSC和安慰劑由門靜脈注入用四氯化碳（CCl4）損傷的肝臟中，檢測ALT、AST和白蛋白水平，發現BMSC并不能減輕纖維化、改善肝功能。由于大部分數據來自小樣本非隨機對照研究，故需進一步的研究以確定在終末期肝硬化患者中，細胞療法的作用以及哪種類型患者應用細胞治療的效果最好，哪種細胞類型治療最安全有效。

4 展望

采用MSC治療脂肪性肝病引起的肝損傷的優勢是：避免了倫理之爭；移植痛苦小，不良反應少，不易引起感染；病程較短，從采集到干細胞培養、純化，再到回輸至患者體內，只需要很短的時間；間充質干細胞移植費用比肝移植低很多；有一定的療效，安全性高，避免了異體移植引起的感染和腫瘤形成風險，避免了異體基因引起的遺傳病和異體蛋白所致免疫排斥反應。

目前間充質干細胞的治療研究仍是初步的，許多問題亟需解決，包括注入的細胞數量、成分、劑量，移植的最佳時機及治療的管理方式等。同時，如何保持間充質干細胞體外擴增后的特性，間充質干細胞的免疫調節和免疫抑制是通過哪些途徑來實現的，怎樣能避免間充質干細胞移植后修復肝損傷的不良作用，都將是今后需要研究的方向。此外，通過建立患者自體骨髓庫、羊水干細胞庫及自體脂肪體外培養的方法，找到安全、有效、易得的干細胞來源，并實現自體細胞移植，將大大拓展脂肪性肝病所致的晚期肝損傷的治療方法。

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