牛卵泡ODF1與ODF2轉錄組發育相關基因篩選及表達差異分析

李鵬飛，孟金柱，謝建山，朱芷葳，劉 巖，姜曉龍，陳建偉，姚曉磊，趙妙妙，呂麗華*

(1.山西農業大學生命科學學院，太谷 030801；2.山西農業大學動物科技學院，太谷 030801)

牛卵泡ODF1與ODF2轉錄組發育相關基因篩選及表達差異分析

李鵬飛1，孟金柱2，謝建山2，朱芷葳1，劉 巖2，姜曉龍2，陳建偉2，姚曉磊2，趙妙妙2，呂麗華2*

(1.山西農業大學生命科學學院，太谷 030801；2.山西農業大學動物科技學院，太谷 030801)

旨在從牛發情周期第一卵泡波中最大卵泡ODF1(The largest follicle at onset of deviation)和第二大卵泡ODF2(The second largest follicle at onset of deviation)轉錄組水平上篩選卵泡發育差異表達基因。采集牛發情周期第一卵泡波ODF1和ODF2，分別分離顆粒細胞并提取總RNA，構建RNA文庫，通過Illumina平臺對ODF1和ODF2測序；篩選出ODF1與ODF2兩個轉錄本之間比值大于2的差異表達基因，并采用qRT-PCR對篩選出的基因在牛發情周期內第一卵泡波優勢卵泡(Dominant follicles，DF)和從屬卵泡(Subordinate follicles，SF)顆粒細胞中功能驗證。共獲得8個卵泡發育差異表達基因，其中7個基因篩選自ODF1/ODF2(BEX2、UBN1、SIK1、SPARCL1、LOC784256、LOC789231和LOC785462)，1個篩選自ODF2/ODF1(SAFB2)；qRT-PCR結果表明，BEX2、UBN1、LOC784256和LOC789231在DF中mRNA表達量極顯著高于SF(P<0.01)，SAFB2在SF中mRNA表達量極顯著高于DF(P<0.01)，SIK1和SPARCL1在SF中mRNA表達量顯著高于DF(P<0.05)，雖然LOC785462在SF中mRNA表達量高于DF，但差異不顯著(P>0.05)。qRT-PCR檢測BEX2、UBN1、LOC784256、LOC789231和SAFB2的結果與高通量測序中該基因在ODF1和ODF2的RPKM的差異趨勢基本一致，而SIK1、SPARCL1和LOC785462不一致。

牛；ODF1；ODF2；轉錄本；卵泡發育；基因

J.C.Venter等[1]發布人類基因組全序列，標志著生物研究進入了后基因組時代。對基因組序列的利用，從不同水平進行研究，例如基因組、轉錄組等。在卵泡發育的不同階段，轉錄、翻譯等在一系列特定基因順序表達基礎上進行，卵泡發育相關基因的特定表達對卵泡的募集、選擇及凋亡發揮關鍵作用[2]。近年來，在卵泡生長和閉鎖規律方面進行了大量研究，尤其是卵泡發育基因與內分泌調控的關系方面取得了一定進展[3-4]。姚曉磊等[3]通過GEO數據庫結合基因功能分析，篩選出6個候選基因。X.Li等[5]通過采用深度測序技術，系統地篩選出與多種免疫通路(Toll通路、IMD通路和MAPK通路)相關的功能基因，并首次檢測到SAAT、FGF等基因的表達。本研究運用新一代高通量測序技術，以轉錄組為基礎，在牛卵泡發育全基因組范圍內規模化篩選與卵泡發育相關基因，結合基因功能分析，運用qRT-PCR對篩選基因進行功能驗證，大大提高了卵泡發育基因篩選的準確性。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品采集

選取8頭10月齡青年母牛，注射PGF2α(前列腺素F2α)同期發情，分別進行為期11 d的飼養管理，此間每天用B超儀檢測并記錄卵泡的生長情況。在第一卵泡波的偏差期啟動時，摘除卵巢并用眼科剪剪下出現偏差時的最大卵泡ODF1和第二大卵泡ODF2，放入滅菌的DPBS中準備分離顆粒細胞。

1.2 主要試劑

Solexa測序芯片、TruSeq RNA Sample Prep Kit、QiaQuick PCR kit、TruSeq SBS kit、裂解緩沖液(Illumina，美國)、PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser、dNTP、DNA Marker DL2000、SYBR?Premix Ex TaqTM II(TaKaRa，大連)，Trizol、DEPC(Invitrogen公司，美國)，固相RNase清除劑(Andybio公司，美國)。

1.3 卵泡發育相關基因的篩選

1.3.1 ODF1和ODF2顆粒細胞總RNA提取 將已經處理好的卵泡用眼科剪剪開，放到盛有DPBS的表面皿上，用細胞刮刀刮取顆粒細胞，DPBS清洗數次，混合液置于無菌EP管，2 000 r·min-1離心10 min，棄上清并加入1 mL RNAiso Plus，提取總RNA。

1.3.2 牛ODF1和ODF2顆粒細胞RNA文庫構建并測序 取ODF1和ODF2總RNA樣品各6 μL，Oligo(dT)磁珠富集后，加裂解緩沖液使其裂解為200 nt左右的片段；以此為模板，加入隨機引物六聚體合成cDNA第一鏈；再加入一系列緩沖液、RNase H和dNTPs，經聚合酶I合成cDNA第二鏈；經QiaQuick PCR kit純化，EB緩沖液洗脫，末端修復，加Poly A尾巴，加5′和3′接頭；瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，PCR擴增，完成整個cDNA文庫構建；Illumina HiSeq 2000測序平臺進行測序。

1.3.3 ODF1和ODF2兩個轉錄本中篩選牛卵泡差異表達基因 從Illumina平臺對ODF1和ODF2測序得到的兩個轉錄本中篩選卵泡發育差異表達基因，參照S.Audic等[6]方法，設定條件：ODF1 RPKM /ODF2 RPKM>2及ODF2 RPKM /ODF1 RPKM>2，結合Gene Ontology(GO)功能顯著性富集分析，使用FDR校正(P<0.05)的基因。

1.4 試驗方法

1.4.1 總RNA提取及反轉錄 試驗所用DF和SF顆粒細胞總RNA均為本課題組前期獲得，具體參照姚曉磊等[3]方法，分別對3頭牛DF和SF顆粒細胞總RNA分別進行反轉錄，反應條件稍作調整：7 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，-20 ℃保存。

1.4.2 引物合成 參考NCBI上的Bostaurus(Calve)的卵泡發育相關基因序列，設計候選基因引物，利用Primer 3.0軟件設計合成引物(表1)；由上海生工生物工程股份有限公司合成。RPLP0為內參基因。

表1 熒光定量引物

Table 1 Primers of quantitative PCR

基因名稱Genesymbol引物序列(5′?3′)PrimersequenceBEX2F：TTGCCTTATGCCTTGAATCC，R：GGTAATAGGAAACGCGCAAGUBN1F：ACCCGTTCTGGAGTGTATGC，R：TCACAGAGGTGCAGTTTTCGSIK1F：ACCTCAGTGGTTTCGAGGTG，R：GTAGGACAGACTGCCCCAAGSPARCL1F：TGTGCGAAGACAGGATTCAG，R：TGCTTGTGTCGGAATAGCACLOC784256F：AGACAACCAAAAGGGCATTG，R：TCACAGAGCACATTGGCTTCLOC789231F：TCGTGCTGTTTGTTTCTTCG，R：AGTCGGCAACTGCTAAATGGLOC785462F：AGACAACCAAAAGGGCATTG，R：TCACAGAGCACATTGGCTTCSAFB2F：TCCTGGAATCCCTTTGTGAG，R：ACAGCGTGTCCTGTGAACTGRPLP0F：CAACCCTGAAGTGCTTGACAT，R：AGGCAGATGGATCAGCCA

1.4.3 qRT-PCR 數據經3方面校正：重復校正、物理校正和內參基因校正，擴增前先制作標準曲線。依據標準曲線和不同基因及不同的擴增條件進行qRT-PCR反應，反應體系為20 μL，嚴格按照qRT-PCR試劑盒說明書進行；反應條件：95 ℃變性10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 25 s，40個循環。

1.5 統計分析

各目的基因的相對表達量采用△△CT法計算，目的基因的相對表達水平= 2-△△CT。結果均用“平均值±標準差”表示，其中各基因的表達量結果均應經內參基因RPLP0表達量校正，數據采用SPSS 18.0統計軟件進行t檢驗分析。

2 結 果

2.1 從牛ODF1和ODF2轉錄本中篩選獲得的卵泡發育相關基因

從Illumina平臺對ODF1和ODF2測序得到的兩個轉錄本中篩選卵泡發育差異表達基因，經過設定ODF1-RPKM/ODF2-RPKM>2或者ODF2-RPKM/ODF1-RPKM過濾，基因功能分析及FDR(P<0.05)校正后，得到8個卵泡發育相關基因(表2)。其中7個基因篩選自ODF1-RPKM/ODF2-RPKM(BEX2、UBN1、SIK1、SPARCL1、LOC784256、LOC789231和LOC785462)，1個基因篩選自ODF2-RPKM/ODF1-RPKM(SAFB2)。

表2 ODF1/ODF2和ODF2/ODF1轉錄本中篩選得到卵泡發育相關基因

Table 2 Candidate genes associated with follicular development selected by ODF1/ODF2 and ODF2/ODF1 transcript analysis

FeatureIDODF1?RPKMODF2?RPKMODF1/ODF2ODF2/ODF1基因功能GenefunctionBEX2345．003141．0642．446-雌激素誘導下調控細胞凋亡UBN12．6641．2712．097-抑制促增殖基因表達SIK11．0910．2145．104-細胞信號通路和細胞分化SPARCL14．1460．7495．539-細胞增殖活性和細胞周期LOC7842562．5920．4515．742-調節雌二醇、睪酮的合成LOC7892312．8980．9802．955-調節垂體前葉促性腺激素的分泌LOC7854626．0891．4274．269-調節皮質醇和性激素合成途徑SAFB21．0612．727-2．569細胞應激、細胞增殖和凋亡過程

2.2 卵泡發育相關基因在第一卵泡波DF和SF顆粒細胞中表達差異

qRT-PCR結果顯示(圖1)，BEX2、UBN1、LOC784256、LOC789231在DF中mRNA表達量極顯著高于SF(P<0.01)，SAFB2在SF中mRNA表達量極顯著高于DF(P<0.01)，SIK1和SPARCL1在SF中mRNA表達量顯著高于DF(P<0.05)，雖然LOC785462在SF中mRNA表達量高于DF，但差異不顯著(P>0.05)。

**和*.分別表示在0.01和0.05顯著水平上的比較結果** and * indicate significant difference at the level of 0.01 and 0.05，respectively圖1 卵泡發育相關基因在牛DF與SF mRNA表達Fig.1 Real time PCR analysis of candidate genes in DF vs SF in follicular development

3 討 論

轉錄組是某一組織或細胞在不同狀態下所有RNA轉錄的集合。轉錄組水平的研究從組織或細胞全方位分析各基因功能及結構，是研究生物分子機理的一種高效方法。RNA-Seq即轉錄組測序技術，和其他測序技術相比，顯著優勢是測序通量高，可以深度挖掘組織或細胞中各基因差異表達的微小變化[7-8]。RNA-Seq技術不僅能夠全面快速得到基因表達圖譜，還可以精確分析長鏈非編碼RNA[9]、可變剪接[10]等序列及結構變異[11]。J.C.Marioni等[12]用相同肝和腎組織分別采用深度測序和芯片技術在檢測差異表達基因方面作對比研究，在相同FDR(False discovery rate)情況下，新一代測序技術比芯片多檢測出30%的差異表達基因。N.J.Croucher等[13]研究表明，Illumina技術具有高度重復性，技術誤差相對較小。本試驗借助RNA-Seq技術對牛發情周期內第一卵泡波中的ODF1和ODF2進行深度測序，找出ODF1 RPKM/ODF2 RPKM>2或者ODF2 RPKM/ODF1 RPKM>2的差異表達基因，結合基因功能顯著性分析，FDR校正(P<0.05)后，共篩選出8個與卵泡發育相關的基因。DF和SF發育過程中，顆粒細胞具有明顯的增殖或凋亡趨勢，因此，選用牛發情周期第一卵泡波中DF和SF為研究對象。采用qRT-PCR技術對篩選得到可能影響卵泡發育基因進行功能驗證。

BEX(Brain expressed X-linked gene)家族是X染色體連鎖基因家族，BEX2是BEX家族中主要成員。X.Zhou等[14]報道，BEX2通過介導JNK信號通路來促進U251細胞的增殖，下調BEX2則促進U251及U87細胞凋亡。A.Naderi等[15]研究表明，BEX2 基因表達水平下調，引起線粒體凋亡，并使細胞周期阻滯于G1期。韓秋悅等[16]證實BEX2可通過調控細胞周期進程來調控細胞增殖和凋亡。UBN1(Ubinuclein 1，泛核蛋白)是一種衰老調控子，參與衰老相關異染色質凝集(SAHF)的形成，進而抑制促增殖基因的表達。K9M-H3和HP1是SAHF的標志性蛋白。M.Narita等[17]研究表明，衰老細胞中SAHF能夠抑制E2F與K9M-H3和HP1啟動子的結合，從而使細胞衰老狀態保持穩定。本研究表明，BEX2和UBN1在DF中mRNA 的表達量極顯著高于SF，推測BEX2是通過促進顆粒細胞的增殖來促使卵泡隨即呈現優勢發育，最終導致其他卵泡閉鎖，而UBN1在牛DF和SF中都有表達，DF和SF中顆粒細胞是否都存在程序性的凋亡，還需要進一步驗證。

鹽誘導激酶(Salt inducible kinase，SIK)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶。研究表明，SIK1可以通過調控CREB來抑制相關基因的表達[18]，而CREP與細胞增殖、類固醇激素的合成等有很大關系[19]。J.D.Feldman等[20]證實，SIK1在大鼠的腎、腦、卵巢都有表達，且卵泡的發育與類固醇激素密切相關。本研究表明SIK1在SF中mRNA的表達量顯著高于DF，這可能由于SIK1通過負調控CREB，進而導致顆粒細胞凋亡和類固醇激素的缺失。SPARCL1(SPARC-like protein 1)是SPARC家族一員。SPARCL1缺失表達與細胞增殖和細胞周期相關[21]。A.Claeskens等[22]研究證實，SPARCL1能夠阻止細胞從G1期到S期，進而抑制細胞增殖。SPARCL1具有抗黏附功能，其在絕大多數腫瘤中表現為表達下調，起著腫瘤抑制作用，原因可能是缺失/突變或者啟動子甲基化[23]。A.Claeskens等[22]研究表明，SPARCL1在卵巢上表達，且表現為下調，在卵巢癌中誘導腫瘤細胞的凋亡。本研究結果顯示，SPARCL1在SF中mRNA表達量顯著高于DF，表明其在卵泡發育過程中為下調基因，進而促進卵泡閉鎖。SAFB(Scaffold attachment factor B，核基質結合因子)是一種多功能蛋白，其中SAFB1和SAFB2都參與發育、細胞增殖和凋亡過程[24]。M.Ivanova等[25]研究表明，SAFB1的缺失導致小鼠生長緩慢與胰島素生長因子-1水平下降有關，SAFB1的缺失導致雌鼠生育能力降低是由于雌二醇和黃體酮水平下降。同時，SAFB1的過表達能夠縮短細胞周期的S期，進而促使細胞凋亡[26]，敲低SAFB1則促進細胞增殖[27]。在牛卵泡發育過程中，SAFB2在SF中過表達可能抑制了顆粒細胞的增殖，這與S.M.Townson等[26]結論一致。

迄今對LOC784256、LOC789231和LOC785462功能研究不夠深入，還未對其命名。LOC789231為促性腺激素釋放激素Ⅱ受體樣物質，主要是通過調節垂體前葉分泌促性腺激素的分泌；LOC784256和LOC785462為類固醇17-α羥化酶的成員，二者的缺陷，能夠導致皮質醇、雌二醇和睪丸酮合成減少，進而影響機體發育[28]。S.Arianne等[29]研究證實，LOC784256與牛的CYP17A1相似度高達98%，而CYP17A1是細胞色素 P450 超家族蛋白之一，主要功能是催化雄激素生成雌激素。

4 結 論

本研究結果表明，通過qRT-PCR檢測BEX2、UBN1、LOC784256、LOC789231和SAFB2基因表達與高通量測序中該基因在ODF1和ODF2的RPKM的差異趨勢基本一致，而SIK1、SPARCL1和LOC785462不一致。同時，BEX2、UBN1、LOC784256、LOC789231、SAFB2、SIK1、SPARCL1參與牛卵泡顆粒細胞的增殖或凋亡，進而影響牛卵巢卵泡的發育。

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(編輯 程金華)

Screening and Analyse Study of Genes Associated with Follicular Development in Bovine ODF1 and ODF2 Transcript

LI Peng-fei1，MENG Jin-zhu2，XIE Jian-shan2，ZHU Zhi-wei1，LIU Yan2，JIANG Xiao-long2，CHEN Jian-wei2，YAO Xiao-lei2，ZHAO Miao-miao2，Lü Li-hua2*

(1.CollegeofLifeScience，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China；2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China)

This study was performed to screen genes associated with follicular development from ODF1(The largest follicle at onset of deviation)and ODF2(The second largest follicle at onset of deviation)in transcript levels of bovine.The largest and second largest follicle were collected from onset of deviation then separated granulosa cells from which extracted total RNA.High-throughput deep sequencing was carried out by sequencing platform of Illumina.According to the results of assessment analysis in significant enrichment analysis of Gene Ontology function and differential expression in gene screening.Further，screening differential expression gene by ODF1/ODF2 or ODF2/ODF1>2 as the candidate genes.By real-time fluorescent quantitative PCR(qRT-PCR) was performed to detect the gene expression pattern between DF and SF granulose cells of the first follicular wave during estrous cycle in bovine.Eight candidate genes related to follicular development were screened and 7 genes(BEX2，UBN1，SIK1，SPARCL1，LOC784256，LOC789231，LOC785462)from ODF1/ODF2 and one (SAFB2)from ODF2/ODF1，BEX2，UBN1，LOC784256，LOC789231 expressed in DF was extremely significantly higher than that in SF(P<0.01).But the expression levels ofSAFB2 was extremely significantly higher in SF than those in DF(P<0.01) andSIK1，SPARCL1 were significantly greater in SF compared with DF(P<0.05).This indifferences trends was consistent between qRT-PCR test results ofBEX2，UBN1，LOC784256，LOC789231，SAFB2 and high-throughput sequencing results of RPKM in ODF1 and ODF2.The qRT-PCR test results ofSIK1，SPARCL1 andLOC785462 was opposite with the high-throughput sequencing of the gene RPKM in ODF1 and ODF2.

bovine；ODF1；ODF2；transcript；follicle development；gene

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.11.007

2015-02-02

國家自然科學基金(31172211)；農業部948項目(2010-Z43)；山西省橫向協作與委托項目(2010HX54)；山西省回國留學人員科研資助項目(2014-重點5)；山西省科技攻關項目(20130311027-2)；山西省人事廳人才引進項目；山西農業大學引進人才博士科研啟動費(2014ZZ04)；科研管理費資助重大項目；標志性成果培育項目(71060003)

李鵬飛(1978-)，男，山西偏關人，博士，副教授，主要從事動物生殖生理方面的研究，E-mail：adamlpf@126.com

*通信作者：呂麗華，E-mail：lihualvsxau@126.com

S823.2

A

0366-6964(2015)11-1961-06