GDF9下調轉基因小鼠模型對繁殖與生長的影響

習欠云，焦 莉，肖 敏，張永亮

(華南農業大學動物科學學院，廣州 510642)

GDF9下調轉基因小鼠模型對繁殖與生長的影響

習欠云，焦 莉，肖 敏，張永亮*

(華南農業大學動物科學學院，廣州 510642)

本研究旨在對轉GDF9 shRNA基因小鼠進行擴群繁殖，統計分析轉基因小鼠的產仔數及增重，檢測GDF9 shRNA、GDF9表達水平以及血清中FSH和GH的水平，以觀察GDF9的下調對轉基因小鼠繁殖性能及生長發育的影響。通過RT-PCR方法，分別檢測了GDF9 shRNA在體內的表達，以及下丘腦、垂體和卵巢中GDF9 mRNA表達水平；同時用ELISA檢測了血液中FSH和GH水平。結果表明，擴群后得到16只GDF9 shRNA陽性小鼠，轉基因GDF9 shRNA在小鼠體內廣泛表達，轉基因小鼠的產仔數與野生型小鼠相比差異顯著(P<0.05)；轉GDF9 shRNA陽性公鼠的體重比陰性公鼠高，且在第7周差異顯著(P<0.05)，而母鼠間體重無顯著差異；與陰性小鼠相比，轉GDF9 shRNA陽性小鼠GDF9基因的表達量在下丘腦、垂體中分別下降35.4%和39.8%，差異顯著(P<0.05)，在母鼠卵巢中表達水平差異不顯著(P>0.05)；陽性母鼠血液中FSH水平比陰性母鼠高55%，差異極顯著(P<0.01)。結果表明，GDF9基因下調可以提高動物繁殖性能，為提高大型牲畜繁殖力提供了有利的素材和靶點參考。

GDF9；RNA干涉；繁殖；轉基因小鼠

GDF9為轉化生長因子β(Transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成員，由兩個外顯子和一個內含子組成。TGF-β超家族由一類結構、功能相關的多肽生長因子亞家族組成，其中包括TGF-β、活化素(Activin)、骨形態發生蛋白(BMP)、生長分化因子(GDF)等。TGF-β除了影響細胞的增殖、分化，同時在胚胎發育、胞外基質形成、骨的形成和重建等方面也起著重要作用。近來研究發現TGF-β超家族中的兩個成員GDF9在促進卵泡發育過程中起到了非常關鍵的作用[1]。

GDF9主要在卵泡中表達[2]，同時在非性腺組織中也有表達，能促進始基卵泡的發育，抑制促黃體生成激素(LH)受體的表達，與FSH協同刺激卵泡生長，主要調控卵泡的生長發育和生殖功能。研究牛早期卵泡發育時，發現較小的卵泡中GDF9的表達高于稍大的卵泡，所以推測卵泡和顆粒細胞分泌的GDF9可顯著地促進卵泡膜細胞的增殖，同時又防止卵泡膜內層過早的分化[3]。D.I.Vage等[4]發現，挪威白羊GDF9基因中，c.1111G>A SNP表現出比其他任何單個SNP都有較高的產仔數，人工授精公羊純合子c.1111A會產生后代比野生型多0.46～0.57的羔羊數。研究表明，GDF9刺激胸苷摻入顆粒細胞從竇前期到排卵前卵泡，從而促進顆粒細胞增殖，抑制FSH刺激孕酮和雌二醇生成，同時也可促進卵泡膜細胞的分化[5-6]。GDF9的重要靶細胞是顆粒細胞，其可刺激顆粒細胞的增殖，進而促進竇前卵泡的發育，亦能調節FSH在顆粒細胞中的作用[7]。本研究擬通過RNA干涉的方法，制備GDF9 shRNA轉基因小鼠模型，檢測下調GDF9基因的表達對動物繁殖性能的影響，為進一步探討提高大型牲畜的繁殖性能提供有利的素材和途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

轉GDF9基因shRNA的FVB小白鼠，4只F0代公鼠，4周齡，健康無特定病原體(Specefic pathogen free，SPF)，由廣州賽業生物科技有限公司制備。飼養房飼養，每天光照12 h，黑暗12 h，溫度21 ℃，同一飼料(南方醫科大學動物中心)，自由飲水。其中轉基因公鼠與野生型母鼠采取1∶3進行擴群繁殖；對這4只F0代公鼠、1只F1代母鼠(來自1號F0代公鼠)和2只F2代母鼠和1只F2代公鼠的后代，每只母鼠所產的前兩胎仔鼠數目進行記錄，每周稱重，統計分析；3周齡時對仔鼠進行PCR檢測，確定陰性或陽性。3～7周齡，進行數據處理與分析，繪制生長曲線。7周齡時將上述仔鼠眼球采血，置于高壓滅菌過1.5 mL離心管，4 ℃靜置2～3 h，3 000 r·min-14 ℃離心15 min，分離血清，-20 ℃保存。小鼠采血完后，立即頸椎脫臼處死，迅速取出卵巢、睪丸、下丘腦、垂體、心、肝、脾、肺、腎及肌肉，投入液氮中，然后置于-80 ℃保存，備用。

1.2 G1小鼠鼠尾基因組DNA提取及PCR擴增

利用Primer Premier 5.0 軟件根據生產轉基因小鼠時構建的載體設計一對引物GFP，檢測轉基因是否為陽性，根據小鼠內參基因和目的基因的序列設計PCR的引物。由上海生工生物公司合成。所用的引物序列見表1。采用Omega組織DNA提取試劑盒提取。PCR反應體系：10×PCR緩沖液2 μL，10 mmol·L-1dNTP 0.5 μL，上下游引物GFP (10 μmol·L-1)各加0.5 μL，基因組DNA 2 μL，TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1) 0.2 μL，補加ddH2O至20 μL。PCR反應：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共30個循環；72 ℃延伸7 min。分別取5 μL PCR產物，1%瓊脂糖凝膠電泳，檢查目的基因擴增效果。

1.3 GDF9 shRNA cDNA模板的制備及實時熒光定量PCR

采用Trizol法提取組織總RNA，質量和濃度檢測后，稀釋成1 μg·μL-1備用。按反轉錄試劑盒miScript Reverse Transcription Kit合成cDNA(QIAGEN)，universal Tag的Oligo-dT作為反轉錄引物。針對轉入鼠體內的GDF9的shRNA設計特異性引物：5′-AAGTCAGTCTTGCTATATACT-3′，并由生工合成。Oligo-dT為通用引物，以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR。PCR反應體系：10×PCR緩沖液2 μL，10 mmol·L-1dNTP 0.2 μL，上下游引物 (10 μmol·L-1)各0.2 μL，模板cDNA 2 μL，DreamTaq酶(5 U·μL-1)0.2 μL，補加ddH2O至20 μL。反應程序：95 ℃1 min；95 ℃15 s，58 ℃15 s，72 ℃40 s，35個循環；72 ℃10 min；4 ℃ 保存。以β-actin為內參，采用2-△△CT法計算基因的相對表達量。

1.4 血清中FSH和GH的測定

血清中FSH和GH的測定應用ELISA試劑盒(武漢華美公司)，具體操作按試劑盒說明進行。

2 結 果

2.1 G1代轉基因小鼠的PCR陽性檢測

G1代小鼠通過PCR檢測確定陰性或陽性，用于體重分析及分子檢測。在29只小鼠中PCR檢測結果如圖1，其中陽性小鼠16只，陰性小鼠13只。

表1 引物序列

H.H2O；M.DL 2000 marker；3～8、10～14、16～18、20、29.小鼠檢測為陽性；其他小鼠檢測為陰性H.H2O；M.DL 2000 marker；3-8，10-14，16-18，20，29.Mice are positive；other mice are negative圖1 G1代小鼠的PCR檢測結果Fig.1 PCR results of electrophoresis for G1 mice

2.2 GDF9-shRNA轉基因鼠產子數及體重的統計分析

8只親代鼠，對每只前2胎轉基因小鼠的產仔數進行了統計分析，結果如圖2所示。GDF9-shRNA轉基因小鼠產仔數比野生型小鼠的產仔數高27.5%，差異顯著(P<0.05)；對小鼠各周的體重數據按性別進行分析，結果如表2所示。陰性母鼠與陽性母鼠的體重在各周齡均無差異；陰性公鼠在各周齡體重均比陽性公鼠高，且在第7周時高6.7%，差異顯著(P<0.05)。各組小鼠的生長率也幾近相同。轉基因小鼠未出現體重異常。

*.差異顯著 (P<0.05)，下同。n=8*.Significant difference(P<0.05)，The same as below.n=8圖2 轉GDF9 shRNA小鼠產仔數統計分析Fig.2 Statistical analysis of litter size of GDF9 shRNA transgenic mice

2.3 GDF9-shRNA在小鼠組織中的RT-PCR檢測

RT-PCR檢測GDF9-shRNA小鼠各組織樣表達情況，結果如圖3所示。各組織均有83 bp的目的條帶，該片段膠回收產物與pMD18T載體連接、轉化，挑取單克隆，測序正確。表明GDF9 shRNA在體內成功表達，且分布廣泛。

表2 GDF9 shRNA轉基因小鼠體重的統計分析

H.H2O；M1.DL 2000 marker；M2.DL 50 marker；1.心；2.肝；3.脾；4.肺；5.腎；6.下丘腦；7.垂體；8.肌肉；9.卵巢；10.睪丸H.H2O；M1.DL 2000 marker；M2.DL 50 marker；1.Heart；2.Liver；3.Spleen；4.Lung；5.Kidney；6.Hypothalamus；7.Pituitary；8.Muscle；9.Ovary；10.Testis圖3 GDF9 shRNA在不同組織中的RT-PCR檢測Fig.3 RT-PCR analysis of GDF9 shRNA expression in different tissues

2.4 GDF9 mRNA在小鼠下丘腦、垂體、卵巢中的表達水平檢測

卵巢GDF9與FSH的分泌有關，且GDF9在下丘腦、垂體中也有表達量。通過RT-PCR檢測這些組織中GDF9的表達量。結果顯示，在下丘腦中的GDF9的表達量，陽性小鼠與陰性小鼠相比下降35.4%(圖4A)，差異顯著(P<0.05)；在垂體中GDF9的表達量，陽性小鼠與陰性小鼠相比下降39.8%，差異顯著(P<0.05)(圖4B)；在卵巢中GDF9的表達量，陽性母鼠比陰性母鼠低，但差異不顯著(P=0.153)(圖4C)。

A.下丘腦，n=11；B.垂體，n=6；C.卵巢，n=6 A.Hypothalamus， n=11；B.Pituitary， n=6；C.Ovary，n=6，respectively圖4 GDF9在不同組織相對表達量Fig.4 Relative expression levels of GDF9 in different tissues

2.5 小鼠血液中GH和FSH的水平檢測

利用試劑盒檢測血液中GH和FSH的水平。結果表明，陽性母鼠比陰性母鼠高45.9%，差異顯著(P<0.05)(圖5A)；陽性公鼠GH水平比陰性公鼠低28.4%，差異不顯著(P>0.05)(圖5B)；陽性母鼠FSH水平比陰性母鼠高55%，差異極顯著(P<0.01)(圖5C)。

**.差異極顯著 (P<0.01)，陽性與陰性樣本數均為13只(6♂，7♀)**.Extreme significant difference (P<0.01)，positive and negative samples are all 13 (6♂，7♀)，respectively 圖5 血清中GH和FSH水平的檢測Fig.5 Detection of GH and FSH levels in serum

3 討 論

RNA干擾技術在活體水平應用廣泛。 D.A.Rubinson等[8]將表達siRNA的慢病毒載體通過顯微注射的方法成功地建立了CD8和p53下調轉基因小鼠，這兩種轉基因小鼠其體內相應基因的表達都顯著降低。M.A.Carmell等[9]通過轉基因的方法將siRNA整合到基因組中穩定表達，成功地沉默了轉基因小鼠中GFP的表達。本實驗室針對GDF9與繁殖性能的相關性，利用RNA干擾技術，篩選并構建了GDF9基因最佳慢病毒干擾質粒，并成功制備轉基因小鼠模型。在此基礎上，本研究通過轉基因小鼠的擴繁及分析，探討GDF9基因下調對動物生長繁殖的影響。

首先，通過PCR對轉GDF9 shRNA的小鼠及子代進行檢測。結果表明GDF9 shRNA成功整合到小鼠基因組，轉基因小鼠模型成功建立。RT-PCR結果也表明在轉基因小鼠的各個組織中均有shRNA表達。本研究中表達shRNA的載體為慢病毒干涉載體，表明該載體具有良好的轉移外源基因的能力。這與已有報道結果一致。慢病毒載體對分裂和非分裂的細胞均具有高效感染能力，并將外源基因有效地整合到宿主染色體上，進而可以持久表達[8]。B.Dieckhoff等利用慢病毒載體在制備的轉基因豬中，也檢測到shRNA在豬的心、肝、脾、肺、腎、肌肉組織中都有表達[10]。其次，為了檢測shRNA在活體水平上對GDF9的干擾效果，本研究檢測了與FSH分泌相關的卵巢，GDF9-shRNA水平較高的下丘腦以及垂體中GDF9的表達量。結果顯示，與陰性小鼠相比，轉基因小鼠下丘腦中GDF9的表達量下降35.4%，差異顯著(P<0.05)；垂體中GDF9的表達量下降39.8%，差異顯著(P<0.05)；卵巢中GDF9的表達量稍有下調，但差異不顯著(P>0.05)。表明shRNA在不同組織表達量不同，對GDF9的干擾效果也可能不同。由于RNAi技術只是下調特定的基因表達，并不是完全敲除靶基因。M.Semaan等[11]對慢病毒載體介導的PERV shRNA轉基因豬的研究中，同樣發現，shRNA在不同個體及同一個體的不同的組織器官中表達量也是不同的。A.Nagao等[12]為了提高shRNA對XPA基因的干擾效率，將多個針對該基因的shRNA串聯在同一表達載體，其干擾效果與穩定性顯著增加。O.Ter Brake等[13]針對HIV-1的不同區域構建了新的由4個shRNA串聯的慢病毒載體，比只有1個shRNA的慢病毒載體對HIV-1的抑制效應強。

研究發現，GDF9純合缺失的雌性小鼠早期卵泡發育停止導致不育，但是雄性小鼠無影響[14]。GDF9的FecGH突變(G8突變)同樣能提高雜合綿羊的排卵率[15]。本研究轉基因小鼠繁殖性能結果顯示，GDF9 shRNA轉基因小鼠產仔數顯著高于陰性小鼠(P<0.5)，而且小鼠出生后并未出現異常現象，這與GDF9在卵巢、垂體、下丘腦表達量下降結果一致。同時，在第7周齡陽性公鼠體重顯著低于陰性公鼠(P<0.5)；而陽性母鼠與陰性母鼠體重在各周齡均無顯著差異。目前對GDF9基因研究主要還是在繁殖方面，對后期個體生長增重方面尚未見相關報道。由于GDF9基因在下丘腦、垂體中也表達，shRNA下調GDF9基因的表達可能對動物生長軸的調控造成影響，并具有一定的性別依賴性。針對該現象的原因，在后續試驗中還需要做深入探討。

動物生長繁殖是一個復雜的調控過程，受遺傳、激素、營養、環境等多因素的影響。本研究通過篩選最優干涉效果的GDF9 shRNA序列，在小鼠模型上獲得驗證。綜上表明，GDF9基因下調可以提高動物繁殖能力，為今后提高大型動物的繁殖性能提供了良好的素材和途徑。

[1] KNIGHT P G，GLISTER C.Local roles of TGF-beta superfamily members in the control of ovarian follicle development[J].AnimReprodSci，2003，78(3-4)：165-183.

[2] MCGRATH S A，ESQUELA A F，LEE S J.Oocyte-specific expression of growth/differentiation factor-9[J].MolEndocrinol，1995，9(1)：131-136.

[3] SPICER L J，AAD P Y，ALLEN D T，et al.Growth differentiation factor-9 (GDF9) stimulates proliferation and inhibits steroidogenesis by bovine theca cells：influence of follicle size on responses toGDF9[J].BiolReprod，2008，78(2)：243-253.

[4] VAGE D I，HUSDAL M，KENT M P，et al.A missense mutation in growth differentiation factor-9 (GDF9) is strongly associated with litter size in sheep[J].BMCGenet，2013，14：1.

[5] VITT U A，MCGEE E A，HAYASHI M，et al.Invivotreatment withGDF-9 stimulates primordial and primary follicle progression and theca cell marker CYP17 in ovaries of immature rats[J].Endocrinology，2000，141(10)：3814-3820.

[6] MAZERBOURG S，KLEIN C，ROH J，et al.Growth differentiation factor-9 signaling is mediated by the type I receptor，activin receptor-like kinase 5[J].MolEndocrinol，2004，18(3)：653-665.

[7] KOBAYASHI N，ORISAKA M，CAO M，et al.Growth differentiation factor-9 mediates follicle-stimulating hormone-thyroid hormone interaction in the regulation of rat preantral follicular development[J].Endocrinology，2009，150(12)：5566-5574.

[8] RUBINSON D A，DILLON C P，KWIATKOWSKI A V，et al.A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells，stem cells and transgenic mice by RNA interference[J].NatGenet，2003，33(3)：401-406.

[9] CARMELL M A，ZHANG L，CONKLIN D S，et al.Germline transmission of RNAi in mice[J].NatStructBiol，2003，10(2)：91-92.

[10] DIECKHOFF B，PETERSEN B，KUES W A，et al.Knockdown of porcine endogenous retrovirus (PERV) expression by PERV-specific shRNA in transgenic pigs[J].Xenotransplantation，2008，15(1)：36-45.

[11] SEMAAN M，KAULITA D，PETERSEN B，et al.Long-term effects of PERV-specific RNA interference in transgenic pigs[J].Xenotransplantation，2012，19(2)：112-121.

[12] NAGAO A，ZHAO X，TAKEGAMI T，et al.Multiple shRNA expressions in a single plasmid vector improve RNAi against the XPA gene[J].BiochemBiophysResCommun，2008，370(2)：301-305.

[13] TER BRAKE O，T HOOFT K，LIU Y P，et al.Lentiviral vector design for multiple shRNA expression and durable HIV-1 inhibition[J].MolTher，2008，16(3)：557-564.

[14] DONG J，ALBERTINI D F，NISHIMOREI K，et al.Growth differentiation factor-9 is required during early ovarian folliculogenesis[J].Nature，1996，383(6600)：531-535.

[15] HANRAHAN J P，GREGAN S M，MULSANT P，et al.Mutations in the genes for oocyte-derived growth factorsGDF9 and BMP15 are associated with both increased ovulation rate and sterility in Cambridge and Belclare sheep (Ovisaries)[J].BiolReprod，2004，70(4)：900-909.

(編輯 程金華)

The Effect of Transgenic Mice Model Down-regulatedGDF9 on Reproduction and Growth

XI Qian-yun，JIAO Li，XIAO Min，ZHANG Yong-liang*

(CollegeofAnimalScience，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，China)

This experiment aims to detect the effect of down-regulation ofGDF9 on reproduction and growth inGDF9 shRNA transgenic mice through statistical analysis of the litter size and weight gain of transgenic mice and detection of biomolecular and blood biochemical indexes such asGDF9 shRNA，GDF9 and serum FSH and GH level after reproduction.The levels ofGDF9 shRNA andGDF9 mRNA expression were detected in hypothalamus，pituitary and ovary via RT-PCR，and serum FSH and GH level were examined using ELISA.The results showed that 16GDF9 shRNA transgenic mice obtained were positive，andGDF9 shRNA in transgenic mice was widely expressed in various tissues.Litter sizes between transgenic and wild mice were significantly different (P<0.05)；Body weight of transgenic male mice was higher than that of control mice with significant difference (P<0.05) in the seventh week，and body weight of female mice did not show significant difference.Compared with the negative mouse，GDF9 gene expression in transgenic mice in hypothalamus and pituitary were decreased by 35.4% and 39.8% (P<0.05)，respectively.In transgenic female mice，GDF9 expression in ovaries was not significantly decreased (P>0.05)，but its serum FSH level was 55% higher than the control (P<0.01).The present study showed down-regulation expression ofGDF9 gene can improve the ability of animal reproduction.It may provide a favorable material and molecular target for producing transgenic large livestock with high reproduction.

GDF9；RNAi；reproduction；transgenic mice

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.07.011

2014-11-26

國家科技重大專項(2013ZX08007003-004)；轉基因重點專項(2014ZX08009-48B)；廣東省自然科學基金(S2013010013215)

習欠云(1973-)，男，江西樟樹人，博士，副教授，主要從事動物生物化學與營養研究，E-mail：xqy0228@163.com；Tel：020-85284937

*通信作者：張永亮，教授，博導，主要從事動物生物化學與營養研究，E-mail：zhangyl@scau.edu.cn

S814.8

A

0366-6964(2015)07-1157-06