基于2D-DIGE/MALDI-TOF-MS技術篩選奶牛低血鈣癥生物標志物

舒 適，夏 成，張洪友，許楚楚，李昌盛，肖鑫煥，王 剛，白云龍

(黑龍江八一農墾大學動物科技學院，大慶 163319)

基于2D-DIGE/MALDI-TOF-MS技術篩選奶牛低血鈣癥生物標志物

舒 適，夏 成*，張洪友，許楚楚，李昌盛，肖鑫煥，王 剛，白云龍

(黑龍江八一農墾大學動物科技學院，大慶 163319)

奶牛乳熱(MF)是一種嚴重的營養代謝性疾病，通常被分為臨床型及亞臨床型低血鈣癥(SH)。奶牛乳熱的診斷通常是應用奶牛血漿中的鈣濃度進行判定的，但是在奶牛乳熱整個發生發展的過程中，發病的具體機制仍是研究的盲點。在本試驗中通過篩選奶牛乳熱、亞臨床低血鈣癥及健康奶牛間生物標志物進而解釋可能的發生機制。選取27頭奶牛作為實驗動物，并根據其血漿鈣濃度及有無臨床癥狀分為乳熱組(MF組)、亞臨床低血鈣組(SH組)和正常組(C組)。在組內每3個樣品混合成為1個混合樣本應用于2D-DIGE試驗。結果得到110個差異蛋白質點，選取其中80個點進行MALDI-TOF-MS質譜分析，得到66個陽性結果并整合成為16種蛋白質。根據試驗結果，選取A2M、HP和PON1進行Western blotting驗證試驗。本試驗首次證實A2M、HP和PON1是奶牛乳熱癥3種新的生物標志物，并分析了其在乳熱癥發生過程中的可能作用機制。

奶牛；乳熱；亞臨床低血鈣癥；2D-DIGE/MALDI-TOF-MS；Western blotting

奶牛低血鈣癥是在奶牛產前產后4周內一種常見的營養代謝性疾病。已有研究結果顯示奶牛臨床型低血鈣癥的發病率從1977年至今，在10個北美國家發生平均值為3.45%，歐洲為6.17%，澳大利亞為3.5%[1]。低血鈣通常分為臨床型低血鈣癥，即奶牛乳熱(milk fever，MF)，以及亞臨床低血鈣癥(subclinical hypocalcemia，SH)。在《默克獸醫手冊》中，正常奶牛血漿鈣濃度為2.25～2.5 mmol·L-1，而當血漿鈣濃度降低至0.5～1.75 mmol·L-1時可認為奶牛患有乳熱，降低至2.0 mmol·L-1則認為是亞臨床低血鈣癥。低血鈣癥能夠通過降低免疫細胞對炎癥反應的應答而導致炎性疾病(如子宮炎等)；降低胃部肌肉收縮導致奶牛真胃移位，采食量降低[2]；通過影響乳頭肌肉收縮，導致乳頭閉合出現困難，最終使奶牛患乳房炎等乳房疾病[3]。眾所周知，奶牛亞臨床低血鈣癥發生的原因是奶牛分娩后泌乳導致血漿鈣大量流失而不能正常提供機體需求造成的。雖然血漿鈣濃度以及其他傳統的方法可以診斷該病，但在發病早期，特別是亞臨床型低血鈣癥，是不確定的。事實上目前為止，奶牛低血鈣癥的具體發生機制仍然是不清楚的，而且需要一些新的診斷標志物用于早期臨床診斷。

奶牛患病自亞臨床型至臨床型，甚至最終導致奶牛死亡通常血漿中的蛋白質會發生變化[4]，因此本研究應用蛋白質組學的技術，從血漿蛋白質在疾病發生過程中的動態變化篩選該病的生物標志物。蛋白質組學技術自1994年提出之后已經獲得了廣泛的應用，涉及人類癌癥[5]、小麥植物[6]、寄生蟲[7]等。雙向凝膠電泳(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)及質譜(mass spectrometry，MS)連用技術是傳統的蛋白質組學方法[8]。熒光雙向差異凝膠電泳(fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis，2D-DIGE)相對于2D-DE能夠做到定量分析，并且可以在同一塊膠上分析復雜的樣品。基質輔助激光離子化飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)通常配合2D-DIGE試驗對發現的差異蛋白質點進行鑒定。

本試驗對臨床型乳熱、亞臨床低血鈣癥及健康奶牛血漿進行2D-DIGE/MALDI-TOF-MS分析，分離鑒定差異表達蛋白質，篩選奶牛低血鈣癥生物標志物，為診斷奶牛低血鈣癥提供新的診斷指標和闡明發生機制提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

在黑龍江某集約化奶牛廣場選取年齡、胎次和體況相近的奶牛27頭，根據其血漿鈣濃度及有無臨床癥狀并排除同時患有其他疾病的奶牛，分為乳熱組(MF組，Ca<1.80 mmol·L-1，并伴有明顯臨床癥狀)、亞臨床低血鈣組(SH組，1.80 mmol·L-1

1.2 血液參數分析

動物在分娩后12 h內進行尾根靜脈血液采集10 mL，EDTA抗凝，迅速離心4 000 g 10 min，分離血漿，-80 ℃保存備用。選取血漿鈣濃度檢測試劑盒(651564-01，Roche，Germany)應用全自動生物分析儀(Modular DPP，Roche，Germany)進行血漿鈣濃度的檢測。

1.3 熒光雙向差異凝膠電泳(2D-DIGE)試驗

1.3.1 樣品處理 動物分為三組，即MF組、SH組和C組。每組9頭奶牛，即9個樣品。根據生物學重復試驗，每個試驗組內三個樣品混合成為一個樣本(表1)，即MF組：MF1、MF2和MF3；SH組：SH1、SH2和SH3；C組：C1、C2和C3。9個樣本等蛋白質質量混合作為內標。三組樣本被隨機標記為Cy3和Cy5，內標熒光標記為Cy2。具體試驗設計見表1。

按照Bradford法測定樣品蛋白質濃度以確定樣品凝膠上樣量，之后對樣品進行高豐度蛋白質的去除，應用GE去血清/血漿白蛋白質/IgG等高豐度蛋白質親和柱去除高豐度蛋白質，使凝膠的分辨率提高，以獲取更多有價值的低豐度蛋白質點。再應用密里博3 kd超濾管對去高豐度蛋白質后的樣品進行除鹽，10 000×g離心30 min。

表1 試驗奶牛基本信息及2D-DIGE試驗設計

1.3.2 第一向固相梯度等電聚焦電泳 應用專業的膠條槽放置膠條，將處理過的待測血漿樣品與水化液混合后，放入膠條，室溫放置30～60 min。用Amersham Biosciences的IPGPhor等電聚焦儀進行第一向等電聚焦電泳。

1.3.3 第二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 將通過第一向等點聚焦后的膠條取出，將其放入平衡緩沖液中。配制分離14～100 ku范圍蛋白質的濃度為12%的均一SDS聚丙烯酰胺分離凝膠，將已經平衡的IPG膠條小心的放入SDS凝膠頂部，用EttanDALTⅡ垂直電泳儀，電泳直至渙酚藍前沿泳至凝膠的底部時，終止電泳。

1.3.4 圖像掃描和分析 應用Typhoon 9410 掃描儀在488/520 nm，532/580 nm，633/670 nm波長分別對Cy2、Cy3、Cy5熒光染料標記的圖像進行掃描。應用DeCyder v.6.5 圖像分析軟件對DIGE圖像進行分析和差異點尋找。快速生物變化分析模塊用來捕捉蛋白質點，并且與3塊膠上的所有蛋白質進行匹配。這些結果應用t檢驗來分析其顯著性。差異點滿足條件：P≤0.05，差異倍數1.5倍以上。1.3.5 質譜分析 根據樣品第二次定量結果，對樣品進行雙向凝膠電泳以得到制備膠。將分析膠上差異蛋白質點與制備膠相對比，找到制備膠上的相應差異蛋白質點，用解剖刀小心切下進行膠內酶解，也可將其凍干備用。然后對質譜結果進行蛋白質鑒定，鑒定搜庫的數據庫為NCBI全庫。

1.4 Western blotting試驗

根據2D-DIGE及MALDI-TOF-MS的試驗結果，選取3種蛋白質進行Western blotting驗證試驗。選取的3種蛋白質分別為對氧磷酶、觸珠蛋白及α-2-巨球蛋白。選取8頭奶牛進行驗證試驗(MF組：3頭；SH組：3頭；C組：2頭)。應用等量的血清在5%～20%的SDS-PAGE凝膠上分離蛋白質，轉PVDF膜。5%脫脂奶粉封膠，37℃ 2 h。加入抗體4 ℃過夜使目標蛋白質與之結合，第二日室溫下加入第二抗體結合1 h。

2 結 果

2.1 差異蛋白質表達的分析

應用2D-DIGE技術分離三組試驗樣本中的差異表達蛋白質，根據表1的試驗設計，本試驗共應用5塊熒光凝膠分離所有樣本。圖1(A-E)是熒光標記差異凝膠電泳圖，在熒光電泳圖右側從上至下是Cy2、Cy3和Cy5分別在各自吸光度下的熒光電泳圖，并應用DeCyder (版本6.04.11，GE Healthcare)軟件包分析。

2.2 差異表達蛋白質的質譜鑒定

根據分析結果，得到110個差異表達蛋白質點，所有差異表達蛋白質點在三組中相互比較均有明顯差異(差異倍數>1.5倍，P<0.05)。選取80個差異表達點進行質譜分析后得到66個鑒定結果，整合66個質譜結果得到16種差異表達蛋白質。圖2顯示16個具有代表性的差異蛋白質點的表達水平。

在16種差異蛋白質中，選取3種差異蛋白質(PON1、HP和A2M)展示其一級及二級質譜圖，見圖3。

2.3 Western blotting結果

根據試驗結果，選取A2M、HP和PON1蛋白質通過Western blotting試驗進行驗證。結果見圖4。結果顯示，凝膠圖結果可看出差異蛋白質在三組之間表達的差異性。

根據Western blotting試驗結果，檢測凝膠表面灰度值，經過分析以組內灰度值的平均值形式得到驗證結果，見圖5。灰度值結果明顯可以看出差異表達蛋白質在三組之間相比較的上下調情況。結果也證實與2D-DIGE結果相一致。

3 討 論

奶牛乳熱是一種在高產奶牛產后常發生的一種營養代謝病。據估計，3%～8%的奶牛都會受到該病的影響，在牛群中發生該病的發病率更高，可達25%～30%。然而，面對較高的發病率以及臨床型和亞臨床型的不良預后，需要一種可以對奶牛乳熱進行早期預警診斷的生物標志物。對于該病的血清學檢測室常用的實驗室診斷手段，但該病在早期一般不易察覺。所以，一種敏感性更高、特異性更強、診斷意義更加明確的新型生物標志物應用于早期診斷該病是十分重要的。

在本研究中，應用2D-DIGE技術篩選出13種差異表達蛋白質，其中8種蛋白質在以往的研究中也提到可能會與奶牛乳熱發生相關。而其中3種蛋白質，是本試驗首次揭示的可能成為奶牛乳熱生物標志物的差異表達蛋白質，并進行了Western blotting試驗的驗證。

巨球蛋白是一類相對分子質量大于400 ku的球蛋白。Alpha-2-macroglobulin(A2M)是其中之一，相對分子質量約720 ku，是一種蛋白酶抑制因子。它主要是在肝上皮實質細胞合成[9]。研究表明，它在兒童期對凝血酶起著重要的作用[10]。另外也有研究結果說明A2M與骨關節炎的發生相關，研究中提到A2M是很多軟骨代謝因子的抑制劑，A2M本身也是一種主要由肝分泌的蛋白酶抑制劑。A2M可以通過抑制以及降低軟骨代謝因子基因的表達來阻止其發揮作用[11]，也就是降低了骨鈣的動員。奶牛發生乳熱是一個血漿鈣濃度遞進降低的過程，即從發病到亞臨床型再到臨床型。根據上述研究結果可提示，當奶牛血漿鈣濃度剛剛開始降低時，A2M表達正常或稍微低于正常值以保證機體內環境平衡。但當血漿鈣濃度持續降低并發展到臨床型時，A2M表達濃度升高，并通過抑制軟骨代謝因子保護骨鈣不被動員。這可能能夠解釋當血漿鈣濃度降低時，骨鈣動員機制為何沒有發揮作用的現象。

對氧磷酶1(PON1)是一種44 ku的糖蛋白，它能夠水解像農藥，神經毒素一樣的有機磷酸脂類[12-15]。PON1主要在肝合成，是組成高密度脂蛋白的一種，該蛋白質在肺、心、腦、腎以及小腸也有低濃度的表達[16]。DIGE和West blotting結果均顯示PON1相對于其他兩組，在乳熱組中表達下調。能夠引起這種結果的原因可能是PON1能夠使甲狀旁腺素受體1表達上調[17]。PTH 在機體鈣磷平衡中是一種重要的激素。當血漿鈣濃度降低時，PTH會迅速增加以促進骨鈣的釋放和腎的重吸收以升高血漿鈣濃度。奶牛發生乳熱通常被解釋為奶牛在產犢后血鈣大量流失不足以滿足機體需求而導致的，在這一發病過程中骨鈣動員和腎重吸收并沒有發生其作用補充血漿中流失的鈣，其原因尚不清楚。然而本試驗的結果可能能夠解釋這一發生機制。

A～E.分別表示Gel1～Gel5，藍色表示內標且用Cy2染色，綠色為Cy3染料染色樣本，紅色為Cy5。每圖右側分別為Cy2，Cy3和Cy5標記樣本在不同吸光度下表現的凝膠圖譜A.Gel1；B.Gel2；C.Gel3；D.Gel4；E.Gel5.Blue：Pooled internal standard labeled with Cy2.Green：Labeled with Cy3.Red：Labeled with Cy5.The 3 pictures right：Individual channels of Cy2，Cy3 and Cy5 for an individual spot圖1 2D-DIGE篩選熒光標記差異凝膠電泳Fig.1 2D-DIGE composite psedocolor image of all samples with intern standard (IS)

圖中每個蛋白質點的比較，均設定某一組樣本的相對含量為100，再將其他兩組與其進行比較。*表示與相對含量為100的組相比較，差異蛋白質有顯著性差異(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)Give the value to a group，and compare with others.The value is 100.* mean significant difference between the group and the 100 (P<0.05)，** mean highly significant difference (P<0.01)圖2 16個代表不同差異蛋白質的差異蛋白質點在三組之間相對含量的比較Fig.2 16 representative proteins compare with each other among the 3 groups

A.點616(A2M)；B.點1 357(HP)；C.點1 082(PON1)A.The peptide mass fingerprinting of No.616 spot (A2M)；B.The peptide mass fingerprinting of No.1 357 spot (HP)；C.The peptide mass fingerprinting of No.1 082 spot (PON1)圖3 A2M、HP和PON1代表蛋白質點的肽質量指紋圖譜Fig.3 The peptide mass fingerprinting diagrams of A2M，HP and PON1

圖4 三種差異蛋白質的WB凝膠圖Fig.4 The WB gel of the 3 difference proteins

圖5 三種差異表達蛋白質WB結果灰度值平均值Fig.5 The average value of each difference proteins in each group

觸珠蛋白(HP)是一種具有結合血紅蛋白(Hb)能力的蛋白質。在血細胞溶解時，HP結合Hb以阻止離子流失及腎損傷[18]。根據網絡蛋白質相互作用軟件STRING (v9.1) (http：//string-db.org/newstring_cgi/show_input_page.pl?UserId=cEzh2SGIXfub&sessionId=GvCTHAfYvG1E )分析結果發現，S100A9蛋白與HP蛋白相關。S100A9又稱S100鈣結合蛋白A9。它在NADPH氧化過程中結合鈣離子發揮作用，而這一調節是NADPH氧化過程中最基本的調節[18]。本研究結果顯示HP為表達下調的蛋白質，推測當奶牛發生乳熱時HP蛋白質表達下調影響了S100A9蛋白在NADPH氧化過程中的調節作用，并通過該過程阻止鈣離子進入血液。

根據以往的研究，本試驗中一部分蛋白質是已經報道過可能與奶牛乳熱的發生有關的蛋白質，如EN1、FGA/FGB/FGG/FG、ALB、APO、C[4，19]。另外還有一個重要的差異表達蛋白質，維生素D結合蛋白。該蛋白質在結果中表達下調，提示可能由于該蛋白質含量的降低使維生素D發生變化，導致奶牛乳熱的發生，但是具體機制需要進一步驗證。

4 結 論

在三組實驗奶牛中成功篩選出13種差異表達蛋白質，并首次提出PON1、HP和A2M是奶牛乳熱癥的三種新生物標志物，并對其乳熱癥發生過程中的作用進行了分析，但其具體機制還需要進一步驗證。

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(編輯 白永平)

Biomarker Discovery for Cows with Hypocalcemia Using 2D-DIGE

SHU Shi，XIA Cheng*，ZHANG Hong-you，XU Chu-chu，LI Chang-sheng，XIAO Xin-huan，WANG Gang，BAI Yun-long

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HeilongjiangBayiAgriculturalUniversity，Daqing163319，China)

Milk fever (MF) is a seriously nutrition metabolism disease which is divide into clinical and subclinical hypocalcemia (SH).The level of Ca in blood combining the clinical signal were always used to diagnose MF.But in the total development progress of this disease the pathogenesis was not clearly.In this study we screened the biomarkers of MF and SH，and want to reveal the possibly pathogenesis.Twenty-seven dairy cows were selected as the experiment animal，and there were 3 groups MF，SH and C according to the blood calcium concentration and the clinical signal of these dairy cows.Every 3 samples were mixed into a hybrid sample in each group，and 9 hybrid samples were crossed into the 2D-DIGE.Eighty of 110 spots，which were found via 2D-DIGE，were selected into mass spectrum.Sixty-six spots were found，and were identified into 16 proteins.A2M，HP，PON1 were selected in verification test by using Western blotting，and the results support the results of DIGE experiment.In this study 16 proteins were found among three groups，and 3 proteins of them were verified first time.Collectively，the results indicate that A2M，HP，PON1 are 3 novel biomarkers for MF，and they may contribute to explore the possible mechanism of MF.

dairy cow；milk fever；subclinical hypocalcemia；2D-DIGE/MALDI-TOF-MS；Western blotting

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.07.022

2014-11-02

國家自然科學基金項目主任基金(30840060)；國家自然科學基金面上項目(30972235)；黑龍江省自然科學基金面上項目(C200916)

舒 適(1986-)，女，浙江寧波人，博士生，主要從事臨床獸醫學的研究，E-mail：519296311@qq.com

*通信作者：夏 成，E-mail：xcwlxyf2014@163.com

S857.2

A

0366-6964(2015)07-1238-08