Am80和TSA對雞Stra8基因啟動子活性的調(diào)控作用

劉志永，左其生，肖天榮，韋光輝，陳庭峰，朱 睿，張振韜，王怡臨，蔣舒穎，張亞妮，李碧春

(揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009)

Am80和TSA對雞Stra8基因啟動子活性的調(diào)控作用

劉志永，左其生，肖天榮，韋光輝，陳庭峰，朱 睿，張振韜，王怡臨，蔣舒穎，張亞妮，李碧春*

(揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009)

旨在確定雞Stra8基因啟動子的主要調(diào)控區(qū)域，預測調(diào)控元件結合位點，探索用他米巴洛丁(Am80)或曲古抑菌素(TSA)誘導對Stra8啟動子活性的調(diào)控作用。將雞Stra8基因5′側翼系列缺失片段插入到pGL3-basic載體構建重組質(zhì)粒，并轉染DF-1和GC-1，通過檢測熒光素酶活性和預測啟動子區(qū)域調(diào)控元件的結合位點，選取合適的啟動子片段并構建其重組質(zhì)粒Stra8-EGFP；將Am80和TSA分別按一定的濃度梯度誘導轉染細胞，進行熒光素酶活性檢測以篩選最佳誘導濃度；用最適劑量的Am80和TSA分別單獨或聯(lián)合誘導轉染重組質(zhì)粒Stra8-EGFP的P19，并檢測各誘導組的綠色熒光表達程度。結果表明，雞Stra8基因啟動子-1 055～+54 bp片段的活性較強，且含有RARα、RXRα和RARβ的結合位點；分別單獨或聯(lián)合使用Am80和TSA對轉染的細胞進行誘導，結果顯示，Am80和TSA協(xié)同作用的熒光素酶活性最高；重組質(zhì)粒Stra8-EGFP轉染細胞后，用Am80(10-5mol·L-1)和TSA(10-6mol·L-1)聯(lián)合誘導可見綠色熒光強度最強。本研究成功分析了雞Stra8基因啟動子的活性和調(diào)控元件的結合位點，確定Am80和TSA共同誘導可顯著提高Stra8基因啟動子調(diào)控活性。

Stra8基因；啟動子活性；調(diào)控元件；Am80；TSA

Stra8是生殖細胞由有絲分裂轉變?yōu)闇p數(shù)分裂前特異表達的基因，在調(diào)控哺乳類和鳥類減數(shù)分裂的起始過程中起到關鍵作用[1]。Stra8一旦缺失，生殖細胞將不能完成減數(shù)分裂。據(jù)研究報道，Stra8缺失的雄鼠不能進入減數(shù)分裂前期；在雌性，Stra8缺失后，生殖細胞沒有出現(xiàn)進入減數(shù)分裂的一系列特征，這表明，Stra8對雄性和雌性均是誘發(fā)減數(shù)分裂和正常減數(shù)分裂前期進行的關鍵[2]。生殖細胞在視黃酸(RA)的激活下表達Stra8，繼而才能從有絲分裂進入減數(shù)分裂前期，產(chǎn)生有性生殖配子[3]。RA的生物活性是通過RA受體(Retinoic receptor，RAR)和RXR受體(Retinoid receptor，RXR)的激活而介導的[4]。RARs和RXRs都具有由不同基因編碼的α、β、γ 3種亞型，RA的生理學功能可被不同的RARs亞型調(diào)節(jié)，其與RXRs結合形成二聚體，RXR具有支架蛋白的作用促進DNA和受體結合[5]。多種輔激活物和輔阻遏物可與RARE結合，影響RA應答基因上RAR-RXR-RA復合物的活性。在RA缺失時，RAR/RXR二聚體招募含有組蛋白去乙酰化酶活性的輔阻遏物復合物，誘發(fā)轉錄抑制[6]；當RA存在時，其與RAR/RXR二聚體結合，組蛋白乙酰轉移酶活性的輔激活物替代輔阻遏物，其能夠誘導轉錄激活，從而發(fā)生與RA應答基因誘導和抑制有關的表觀遺傳修飾[7]。

他米巴洛丁(Tamibarotene，Am80)是RARα的激活劑，其能夠與RARα特異性結合[8]，且其活性大約是全反式視磺酸(ATRA)的10倍。Stra8啟動子上與RARE結合的組蛋白去乙?；?HDAC)，能使染色質(zhì)凝聚，基因轉錄沉默[9]。曲古抑菌素(Trichostin A，TSA)與HDAC結合，使其失去活性。目前在Stra8基因的相關研究中，ATRA是常用的誘導劑，而其他對Stra8有較好誘導作用的誘導劑的研究還甚少。本試驗通過應用生物信息學分析和雙熒光素酶活性檢測系統(tǒng)技術，尋找與Stra8基因轉錄有關的調(diào)控元件，以此來檢驗Am80和TSA對Stra8基因啟動子調(diào)控活性的影響。通過研究Am80和TSA對Stra8基因啟動子活性的調(diào)控作用，以期為Stra8基因誘導劑的篩選提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

試驗動物購自中國家禽研究所，采集蘇秦黃雞公雞的睪丸組織，經(jīng)液氮速凍后-70 ℃長期保存。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、克隆載體pMD19-T Vector以及各種限制性內(nèi)切酶和修飾酶 購自TaKaRa公司；pGL3-Basic(螢火蟲熒光素酶報告基因載體)和pRL-SV40(海腎熒光素酶對照報告基因載體)購自Promega公司；離心柱型動物組織基因組DNA提取試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；去內(nèi)毒素小提試劑盒購自Omega公司；雙熒光素酶檢測系統(tǒng)購自Promega公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。DF-1(雞胚成纖維細胞)和P19(小鼠胚胎畸胎瘤細胞)均為本實驗室保存；GC-1(小鼠精原細胞系)購自ATCC。引物合成及測序由上海Invitrogrn生命技術公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 生物信息學分析 利用在線軟件TFsearch(http：//www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)和AliBaba 2.1(http：//www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html)對Stra8基因啟動子區(qū)及其潛在的轉錄因子結合位點進行預測和分析。

1.2.2 雞Stra8基因啟動子區(qū)系列缺失片段的擴增 根據(jù)GenBank上紅色原雞Stra8基因序列(GeneID：XM_416179)翻譯起始位點(ATG)上游3 kb區(qū)域的序列特征分析結果，采用系統(tǒng)缺失的方法設計引物，上下游引物5′端分別有KpnⅠ和HindⅢ酶切位點(引物序列見表1，酶切位點序列加有下劃線)，酶切位點前面為保護堿基，以保證酶切位點不丟失。

以基因組DNA 為模板，使用PrimeSTAR?Max進行PCR擴增。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行切膠回收，將純化后的PCR產(chǎn)物與pMDTM19-T Vector進行連接，并轉化至感受態(tài)細胞DH 5α中，經(jīng)KpnⅠ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定及測序驗證，構建正確的克隆載體。

表1Stra8基因系列缺失片段引物序列

Table 1 Primer sequences ofStra8 gene missing mutants

名稱Name引物序列(5'→3')Primersequence退火溫度/℃Tm片段長度/bpSizepGL3-P1(-201～+54bp)F:GGGGTACCGGGAGCAAAGCTGCGTCCR:CCAAGCTTCCCGTTACCAATTGCACGTA61.5255pGL3-P2(-500～+54bp)F:GGGGTACCGGTCCGCCTTGATCTCCGR:CCAAGCTTCCCGTTACCAATTGCACGTA60.5554pGL3-P3(-739～+54bp)F:GGGGTACCATTAGCGAGCGGCACGAAGR:CCAAGCTTCCCGTTACCAATTGCACGTA60.5793pGL3-P4(-1055～+54bp)F:GGGGTACCTCGATACAGGCTGGTTTTCAGR:CCAAGCTTCCCGTTACCAATTGCACGTA58.51109pGL3-P5(-1209～+54bp)F:GGGGTACCATCACATAAGGACTGCCCGAR:CCAAGCTTCCCGTTACCAATTGCACGTA60.51263pGL3-P6(-1629～+54bp)F:GGGGTACCCCAAATTAAGCTCCAGGCAAR:CCAAGCTTCCCGTTACCAATTGCACGTA58.51683pGL3-P7(-1901～+54bp)F:GGGGTACCGGGAGCAAAGCTGCGTCCR:CCAAGCTTCCCGTTACCAATTGCACGTA591955

下劃線字母分別表示限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和Hind Ⅲ的酶切位點

Underlines indicate the restriction sites ofKpnⅠ和Hind Ⅲ

1.2.3 系列缺失表達載體和Stra8-EGFP表達載體的構建 用KpnⅠ和Hind Ⅲ分別雙酶切克隆載體和pGL3-basic載體，酶切片段經(jīng)回收純化后，使用T4 DNA Ligase進行連接，并轉化至感受態(tài)細胞DH5α中，經(jīng)KpnⅠ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定及測序驗證正確后分別命名為pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P3、pGL3-P4、pGL3-P5、pGL3-P6、pGL3-P7。

以重組質(zhì)粒pGL3-P4為模板進行PCR擴增，用AseⅠ和Hind Ⅲ對獲得的目的片段和pEGFP-N1進行雙酶切。對目的片段和載體片段進行回收純化、連接，并轉化至感受態(tài)細胞DH5α中，經(jīng)AseⅠ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定及測序驗證正確后分別命名為Stra8-EGFP。

1.2.4 細胞瞬時轉染 轉染前將細胞以5×105的密度鋪于24孔板，待細胞完全貼壁生長至80%融合時，參照Lipofectamine 2000使用說明書，分別將各重組質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-SV40以25∶1的比例共轉染到DF-1和GC-1細胞中，同時設置陰性對照組(pGL3-basic空質(zhì)粒與pRL-SV40質(zhì)粒共轉)，6 h后換液，換液后4 h，把Am80和TSA分別按一定的濃度梯度加入培養(yǎng)基中，并加入ATRA(10-6mL·L-1)作為對照來篩選最佳誘導濃度；其后用最適劑量的Am80和TSA單獨或聯(lián)合誘導轉染的細胞，均在48 h后收集細胞，進行雙熒光素酶活性檢測，每組重復3次。

1.2.5 雙熒光素酶活性檢測 將收集后的細胞取100 μL加入到96孔板中，按Dual-Glo?Luciferase-Assay system 試劑說明書要求，首先加入100 μL Dual-Glo?Luciferase Buffer，15 min后檢測螢火蟲熒光素酶活性值；然后，加入100 μL Dual-Glo?Stop & Glo?Buffer，15 min后檢測海腎熒光素酶活性值，兩者之比值即為熒光素酶相對活性值(Relative luciferase activity，RLA)，采用“平均值±標準差”形式表示(具體操作步驟見Promega Dual-Glo?Luciferase Assay System)。

1.2.6 穩(wěn)定轉染質(zhì)粒Stra8-EGFP的細胞篩選和GFP檢測 用G418按一定的濃度梯度篩選轉染過Stra8-EGFP質(zhì)粒的P19細胞2周左右，能使P19細胞全部死亡的G418最低濃度為最佳篩選濃度，該篩選濃度的確定可用于后續(xù)的G418抗性陽性細胞的篩選。對經(jīng)過篩選的細胞培養(yǎng)、接種于24孔板，待細胞生長匯合至80%～90%時，轉染Stra8-EGFP質(zhì)粒。轉染4 h后，將Am80和TSA以最適劑量單獨或者聯(lián)合對轉染的細胞進行誘導，并加入ATRA(10-6mL·L-1)作為對照，在36 h后使用熒光顯微鏡檢測不同誘導組的綠色熒光表達情況。

2 結 果

2.1 雞Stra8基因啟動子區(qū)系列缺失片段的PCR擴增

2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明，所獲得的一系列缺失體的PCR產(chǎn)物大小分別與預期長度一致(圖1)，表明成功獲得目的DNA片段。

M.DNA相對分子質(zhì)量標準；1～7.P1(255 bp)、P2(554 bp)、P3(793 bp)、P4(1 109 bp)、P5(1 263 bp)、P6(1 683 bp)、P7(1 955 bp)M.DNA marker DL5000；1-7.PCR products using primers of P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7圖1 啟動子缺失片段的PCR結果Fig.1 PCR products of different promoters

2.2 雞Stra8基因啟動子區(qū)系列缺失載體的構建

用KpnⅠ和Hind Ⅲ雙酶切7個系列缺失載體，1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得相應啟動子片段和載體片段的兩條帶，大小與預期結果相符，說明載體構建正確，可用于后續(xù)試驗。酶切電泳見圖2。

M.DNA相對分子質(zhì)量標準；1～7.分別為重組質(zhì)粒pGL3-P1(-201～+54 bp)，pGL3-P2(-500～+54 bp)，pGL3-P3(-739～+54 bp)，pGL3-P4(-1 005～+54 bp)，pGL3-P5(-1 209～+54 bp)，pGL3-P6(-1 629～+54 bp)，pGL3-P7(-1 901～+54 bp)的酶切結果M.DNA marker DL5000；1-7.Restriction enzyme digestion products of the vector pGL3-Stra8圖2 質(zhì)粒pGL3-Stra8酶切電泳結果Fig.2 Identification of pGL3-Stra8 plasmid

2.3 雞Stra8基因啟動子系列缺失片段活性比較

用上述構建的7個重組質(zhì)粒和pRL-SV40質(zhì)粒分別共轉染DF-1和GC-1細胞系，pGL3-basic質(zhì)粒作為陰性對照，檢測各自啟動子活性(圖3)。結果表明，雞Stra8基因啟動子系列缺失片段在這兩種細胞中的活性變化趨勢基本一致，重組質(zhì)粒pGL3-P2的啟動子活性最強，pGL3-P1啟動子活性基本喪失，說明啟動子的核心區(qū)域位于-554～-255 bp。

2.4Stra8基因啟動子區(qū)轉錄調(diào)控及調(diào)控元件分析

根據(jù)啟動子活性分析結果Stra8基因上游存在著不同的調(diào)控功能區(qū)域，使用TFsearch和AliBaba 2.1在線軟件分析Stra8啟動子-1 955～+45 bp區(qū)域發(fā)現(xiàn)了調(diào)控元件RARα、RXRα和RARβ (圖4)。結合啟動子缺失片段的活性高低，選取重組質(zhì)粒pGL3-P4的啟動子片段來構建Stra8-EGFP重組質(zhì)粒用于后續(xù)研究。

圖3 Stra8基因啟動子缺失片段在DF-1和GC-1細胞中的活性Fig.3 Activity of different promoters of Stra8 in DF-1 and GC-1 cells

圖4 Stra8基因-1 955～+45 bp區(qū)調(diào)控元件結合位點預測Fig.4 Prediction of regulatory elements binding sites at -1 955-+45 bp of Stra8 gene

2.5 Stra8-EGFP質(zhì)粒的構建

用和AseⅠ和Hind Ⅲ對重組質(zhì)粒Stra8-EGFP雙酶切，1%凝膠電泳檢測，獲得相應啟動子和載體片段，酶切電泳見圖5。

2.6 Am80和TSA誘導對Stra8啟動子活性的影響

使用不同濃度的Am80和TSA對重組質(zhì)粒pGL3-P4轉染的DF-1細胞進行誘導，結果表明，二者分別在濃度為10-5和10-6mol·L-1時相對熒光素酶活性值最高，說明此濃度是Am80和TSA最佳誘導濃度。因TSA和Am80調(diào)控基因表達的作用方式不同，二者可共同使用而發(fā)揮較高調(diào)控活性。當TSA和Am80聯(lián)合誘導時，其相對熒光素酶活性值達到最高，比ATRA誘導組提高94倍，且與其他誘導組相比差異極顯著(P<0.01)，這表明TSA和Am80共同作用時誘導效果最好(圖6)。

M．DNA相對分子質(zhì)量標準；1.重組質(zhì)粒Stra8-EGFP(1 109 bp)的雙酶切鑒定結果M.DNA marker DL5000；1.Restriction enzyme digestion products of the vector Stra8-EGFP圖5 重組質(zhì)粒Stra8-EGFP酶切電泳結果Fig.5 Identification of recombination plasmid Stra8-EGFP

**.差異極顯著(P<0.01)；*.差異顯著(P<0.05)。A.Am80和TSA分別在不同濃度(mol·L-1)時對Stra8基因基因啟動子活性的影響；B.Am80(10-5mol·L-1)或TSA(10-6mol·L-1)對Stra8基因啟動子活性的影響**.P<0.01；*.P<0.05.A.Effects of Am80 and TSA at different concentrations on the activity of Stra8 promoter；B.Effects of Am80(10-5mol·L-1) and TSA(10-6mol·L-1) on the activity of Stra8 promoter圖6 Am80和TSA誘導作用對質(zhì)粒pGL3-P4啟動子活性的影響Fig.6 Effects of the induction of Am80 and TSA on the promoter activity of plasmid pGL3-P4

2.7 Am80和TSA在細胞水平上對Stra8啟動子的調(diào)控作用

經(jīng)過2周的篩選，在濃度為400 μg·mL-1時P19細胞基本全部死亡，故此為最佳篩選濃度。在轉染過Stra8-EGFP質(zhì)粒，待培養(yǎng)后加入ATRA、Am80和TSA，36 h后用熒光顯微鏡觀察，結果，Am80和TSA共同誘導組的綠色熒光表達強度最高(圖7)，且不同誘導組的熒光表達強度的趨勢與其相對熒光素酶值的趨勢一致，由此可知，Am80和TSA共同作用對Stra8啟動子的調(diào)控作用最強。

1.ATRA誘導組；2.Am80誘導組；3.TSA誘導組；4.Am80和TSA聯(lián)合誘導組1.ATRA induction group；2.Am80 induction group；3.TSA induction group；4.Am80 and TSA in combination induction group圖7 Am80 和TSA誘導作用對質(zhì)粒Stra8-EGFP綠色熒光表達強度的影響 200×Fig.7 Effects of the induction of Am80 and TSA on the expression of green fluorescence of Stra8-EGFP plasmid 200×

3 討 論

Stra8是ATRA誘導小鼠P19畸胎瘤干細胞分化中分離的重要基因片段[10]，而且在誘發(fā)減數(shù)分裂和正常減數(shù)分裂前期進行的過程中發(fā)揮重要作用。全反式維甲酸(Alltransretinoic acid，ATRA)作為RA的天然異構體，在體內(nèi)除部分代謝滅活外，主要的是經(jīng)過異構酶的作用代謝為活性產(chǎn)物：11cis-RA、13cis-RA、9cis-RA這些順式維甲酸與維甲酸受體(RARs)及維甲酸類受體(RARs)結合，在mRNA的水平對細胞的增殖和分化發(fā)揮作用[11]。Am80是維生素A活性代謝產(chǎn)物，全反式視磺酸的類似物。組蛋白是染色體折疊所必須的蛋白，其和DNA結合的松散程度被認為是轉錄因子和啟動子結合的關鍵因素[12]。具有HAT活性的組蛋白可以充當輔助激活劑，而具有HDAC活性的組蛋白能夠誘導轉錄激活[13]。TSA是去乙?；M蛋白酶(HDAC)的最有效抑制劑[14]，組蛋白去活化是減數(shù)分裂過程中染色體準確折疊所必須的[15]。鑒于Stra8基因啟動子的調(diào)控原理，本試驗選用Am80和TSA來探索其對Stra8啟動子活性的影響。

為了篩選比ATRA更有效的Stra8基因的誘導劑，本研究根據(jù)雞Stra8基因啟動子序列，構建了7個不同長度的啟動子片段，分別轉染DF-1及GC-1細胞系。雙熒光素酶活性檢測的結果表明，不同重組質(zhì)粒pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P3、pGL3-P4、pGL3-P5、pGL3-P6和pGL3-P7在細胞系DF-1和GC-1中的活性趨勢一致，而pGL3-P7在兩細胞系中基本沒有活性。根據(jù)此檢測結果，運用TF search和AliBaba2.1對Stra8基因啟動子序列進行生物學信息分析，發(fā)現(xiàn)在此區(qū)域存在受體RARα、RXRα和RARβ。Am80以配體的形式與核受體-視磺酸受體(RARα)結合，在被激活后RAR和RXR結合形成RAR/RXR二聚體，并結合到特異性DNA片段上[16]，從而啟動目的基因的表達。TSA作為組蛋白去乙酰化酶(HDAC)的抑制劑，其能夠通過與其結合使其失去活性，利于RAR/RXR二聚體招募組蛋白乙?；?HAT)，因HAT具有輔助激活的作用，從而產(chǎn)生諸如染色質(zhì)重塑的表觀遺傳修飾，誘導目的基因表達。使用Am80對重組質(zhì)粒pGL3-P4轉染的DF-1細胞進行誘導時，相對熒光素酶活性值比ATRA誘導組的值提高；當Am80和TSA聯(lián)合誘導時，其相對熒光素酶活性值比ATRA誘導組的值提高。在用ATRA和TSA對重組質(zhì)粒pEGFP-Stra8轉染的F19細胞誘導時，發(fā)現(xiàn)Am80和TSA誘導組表達GFP的強度高于ATRA誘導組。以上研究結果說明，Am80和TSA協(xié)同作用可以顯著提高Stra8基因啟動子的調(diào)控活性。

4 結 論

本研究利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)，結合生物信息學分析確定了Stra8基因啟動子區(qū)域上調(diào)控元件(RAR、RXR)存在，并通過檢測Am80和TSA對Stra8啟動子的調(diào)控作用，驗證了Am80(10-5mol·L-1)和TSA(10-6mol·L-1)共同誘導對Stra8啟動子轉錄調(diào)控活性影響最大，為進一步篩選Stra8基因的誘導劑提供參考依據(jù)。

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(編輯 郭云雁)

Regulatory Effects of Am80 and TSA on ChickenStra8 Gene Promoter Activity

LIU Zhi-yong，ZUO Qi-sheng，XIAO Tian-rong，WEI Guang-hui，CHEN Ting-feng，ZHU Rui，ZHANG Zhen-tao，WANG Yi-lin，JIANG Shu-ying，ZHANG Ya-ni，LI Bi-chun*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China)

The aims of this study were to identify the main regulatory regions of the chickenStra8 gene promoter，to predict the binding sites of the transcription elements，and to investigate the regulatory effects of Am80 and TSA on the chickenStra8 gene promoter activity.A series of promoter missing mutants were directly subcloned into pGL3-Basic vector，and the recombinant plasmids were transfected into DF-1 and GC-1 cells.By detecting luciferase activity and predicting binding sites of regulatory elements of promoter regulatory region，the optimal promoter fragment was selected to construct recombinant plasmid Stra8-EGFP.Am80 and TSA were applied to screen the best induced concentration，Am80 and TSA with optimal dose singly and in combination were used to induce transfected cells，and the green fluorescence expression levels in induced groups were detected.The chickenStra8 gene promoter fragment -1 055-+54 bp had stronger activity，and had the binding sites of RARα，RXRα and RARβ；Am80 and TSA singly and in combination were applied to induce the transfected cells，and the luciferase activity was highest in the cells induced by Am80 and TSA in combination.After the cells were transfected by Stra8-EGFP，the expression of green fluorescence were the highest in cells induced by Am80(10-5mol·L-1) and TSA(10-6mol·L-1) in combination.The activity and binding sites of regulatory elements of chickenStra8 gene promoter were successfully analyzed，and combined actions of Am80 and TSA significantly could promote the activity ofStra8 gene promoter.

Stra8 gene；promoter activity；regulatory element；Am80；TSA

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.004

2013-12-27

國家自然科學基金項目(31272429)

劉志永(1986-)，男，河南商丘人，碩士，主要從事胚胎工程和發(fā)育生物學研究，E-mail：864886521@qq.com

*通信作者：李碧春，教授，E-mail：yubcli@yzu.edu.cn

S831；S813.3

A

0366-6964(2015)06-0896-07