復方中藥對肉雞腹水綜合征肺組織NO、ET-1的作用及機制

韓燁晨，蘇曉菲，王俊武，張 娟，朱昱波，程 佳，員世宇，孫耀貴，王文魁，李宏全，段智變*

(1.山西農業大學動物科技學院，太谷 030801；2.山西省代縣動物檢疫站，代縣 034200；3.河南科技學院動物科學學院，新鄉 453003)

復方中藥對肉雞腹水綜合征肺組織NO、ET-1的作用及機制

韓燁晨1#，蘇曉菲2#，王俊武1，張 娟1，朱昱波3，程 佳1，員世宇1，孫耀貴1，王文魁1，李宏全1，段智變1*

(1.山西農業大學動物科技學院，太谷 030801；2.山西省代縣動物檢疫站，代縣 034200；3.河南科技學院動物科學學院，新鄉 453003)

為研究腹水綜合征(AS)肉雞肺組織NO、ET-1及相關指標變化和復方中藥對其的防治作用，將316羽14日齡羅斯肉雞隨機分為空白組(N組，常溫，常規飼養)、模型組(C組，9～11 ℃，添加3%豬油和4%魚粉的高能飼料，0.12% Na+飲水飼養)和復方中藥高(T1)、中(T2)、低(T3)劑量組(飼養同C組，每天于飲水中分別給予2、1、0.5 mL·kg-1復方中藥)以及L-Arg組(L組，飼養同C組，每天于飼料中添加1% L-Arg)。結果表明：與N組相比，35和45日齡C組肉雞出現典型臨床癥狀，腹水發病率、腹水心臟指數和肺組織NO及ET-1含量、iNOS活性、ETARmRNA相對表達量顯著增加(P<0.01或P<0.05)，肺組織cNOS活性和NO/ET-1顯著降低(P<0.01)；與C組相比，T1、T2和L組均能改善臨床癥狀及上述指標(P<0.01或P<0.05)。肉雞肺組織NO及ET-1含量、ETARmRNA相對表達量和iNOS活性升高，cNOS活性降低，導致NO、ET-1失衡，參與了AS的發生；氣血雙補、行氣利水的復方中藥能有效防治AS。

復方中藥；肉雞腹水綜合征；一氧化氮；一氧化氮合酶；內皮素-1；內皮素A型受體

腹水綜合征(ascites syndrome，AS)是主要發生于快速生長期肉雞的一種營養代謝病，寒冷季節易發，病因涉及遺傳因素、缺氧、低溫、組織損傷、營養、應激和疾病等方面，主要臨床癥狀是腹水、右心肥大、肺和肝充血腫大，死亡率可達肉雞總死亡率的25%，嚴重影響養禽業的發展。研究表明，改善心肺功能、降低肺血管收縮性阻力，改善雞群管理及環境條件，合理搭配飼料，嚴格執行防疫制度，在飼料中添加抗氧化藥物[1]、脲酶抑制劑[2]、L-精氨酸[3]等措施可降低AS的發生率和死亡率，但目前尚沒有預后良好的治療藥物。

AS發病的中心環節是肺動脈高壓(pulmonary hypertension，PH)，而肺血管舒縮功能異常是PH的直接原因。一氧化氮(nitric oxide，NO)和內皮素-1(endothelin-1，ET-1)是血管分泌的重要活性物質，其含量及平衡直接決定血管的舒縮功能。研究表明，禽類肺組織深嵌于肋間隙，順應性相對較低，同時，肺組織無肺泡，密布的毛細血管和毛細支氣管直接接觸形成網狀結構，血管充盈度高，血流量有限，肺組織功能與肺組織血管活性物質密切相關[4]。

中藥作為純天然產物，具有低殘留、安全性高、毒副作用小等優點，在畜禽疾病防治上具有獨特優勢。研究表明，黃芪、當歸、丹參、茯苓、大腹皮等傳統中藥能夠通過調節NO、ET-1及一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活性，來調節血管舒縮功能[5-13]。本試驗通過測定不同日齡AS肉雞肺組織NO、ET-1含量及相關的NOS活性、內皮素特異性A受體(endothelin A receptor，ETAR)相對表達量，并以黃芪、當歸、丹參、茯苓、大腹皮自擬復方進行治療觀察，為AS及其中藥防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物分組及處理

1日齡羅斯肉雞316羽(雌雄不限)及三段式飼養飼料(購自山西省文水縣大象禽業有限公司)。試驗于11月至次年1月進行。常規育雛至14日齡，健康雞隨機分為6組(表1)。依據文獻方法[14-15]，采用低溫(9～11 ℃)、高能飼料(添加3% 豬油、4% 魚粉)、高鈉(飲水總Na+為0.12%)多因素法誘發肉雞腹水綜合征試驗模型。調查表明，肉雞腹水綜合征的發病時間和病死時間主要集中在31～45日齡[16]，因此于35、45日齡分別隨機抽取10羽雞剖取心和肺組織。心臟用于測定腹水心臟指數，肺組織用于測定NO和ET-1含量、cNOS和iNOS活性及ETARmRNA相對表達量。

1.2 制備復方中藥藥劑

以黃芪、當歸、丹參、茯苓、大腹皮組方(藥材購自山西省太谷縣藥材公司)，配比依次為3∶2∶2∶2∶1。清水浸泡30 min后煎煮40 min，紗布過濾，收集藥液，重復3次，合并藥液減壓蒸餾濃縮至1 g·mL-1湯劑，-20 ℃保存備用，飼喂前溫化處理。

1.3 主要化學試劑及儀器設備

NO、NOS試劑盒(南京建成生物工程研究所)，ET-1試劑盒(上海藍基生物科技有限公司)，Trizol?Reagent 試劑盒(Invitrogen，美國)，SYBR PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒(TaKaRa，日本)，SYBR?Premix ExTaqTMⅡ(TaKaRa，日本)。Multiskan Mk3型酶標儀(Thermo，美國)，Stratagene Mx3000P實時熒光定量PCR儀(Stratagene，美國)，ND-1000核酸蛋白測定儀(Nanodrop，美國)，Universal HoodⅡ核酸蛋白成像儀(BIO-RAD，美國)。

表1 試驗分組、藥物劑量及飼養方式

Table 1 Groups，drug dose and breeding ways

組別Group樣本數/只Samples中藥劑量Drugdose溫度/℃Temperature飼喂方式Diet飲水Drinkingwater空白組N52-20～25(常溫)基礎日糧常規模型組C53-9～11基礎日糧+3%豬油+4%魚粉0.12%Na+高劑組T1522mL·kg-19～11基礎日糧+3%豬油+4%魚粉0.12%Na+中劑組T2531mL·kg-19～11基礎日糧+3%豬油+4%魚粉0.12%Na+低劑組T3530.5mL·kg-19～11基礎日糧+3%豬油+4%魚粉0.12%Na+L-Arg組L53-9～11基礎日糧+3%豬油+4%魚粉+1%L-Arg0.12%Na+

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 AS判定標準 以患雞臨床癥狀(皮膚發紺，腹部膨大有波動感)、剖檢(腹腔內有大量膠凍狀液體，肝充血腫大，有血漿凝塊附著)和腹水量(大于20 mL)[17]為判定AS標準。

1.4.2 腹水心臟指數(ascites heart index，AHI) 右心室重與全心室重的比值(RV/TV)，取心臟，沿冠狀溝剪去兩心房，清除附著的脂肪組織及血凝塊，稱取全心室重量(TV)，沿前后縱溝剪下右心室(RV)，稱重，計算AHI[14]。

1.4.3 NO、ET-1含量和cNOS、iNOS活性測定 取0.1～0.2 g肺組織，勻漿機制備10%勻漿，2 500 r·min-1離心15 min，取上清液，按試劑盒說明測定肺組織NO及ET-1含量和cNOS及iNOS活性。

1.4.4 肺組織ETARmRNA相對表達量 按Trizol?Reagent試劑盒說明書提取肺組織總RNA，DEPC處理水溶解，電泳檢測RNA完整性，ND-1000核酸蛋白測定儀測定總RNA的質量濃度和純度，調整質量濃度至1 000 ng·μL-1左右，-80 ℃保存。按SYBR PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒操作說明進行反轉錄，各樣本取1 000 ng總RNA，以Oligo(dT)為反轉錄引物，合成cDNA第一鏈。反轉錄體系：Total RNA 1 000 ng，5×Prime?RT Master Mix 6 μL，加去RNA酶雙蒸水至30 μL。反轉錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s；產物-20 ℃保存。以β-actin為持家基因，根據GallusgallusETAR基因mRNA序列(NM204119)，應用Primer 3.0軟件設計引物，并由TaKaRa有限公司合成(表2)。

表2 引物序列、退火溫度及PCR產物長度

Table 2 Primer sequences，annealing temperature and PCR product size

基因Gene引物序列(3'-5')Primersequence退火溫度/℃AnnealingtemperaturePCR產物長度/bpLengthETARForward:AATGGCCCGAATGCACTGATAReverse:CTGCCCAAATTCAGAATCTCCAA58131β-actinForward:ATGAAGCCCAGAGCAAAAGAReverse:GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA58223

取合成的cDNA原液，按2倍梯度稀釋8個濃度梯度制作β-actin和ETARmRNA基因熒光定量PCR標準曲線、擴增曲線和熔解曲線，qRT-PCR檢測樣本。反應體系及程序參考SYBR?Premix ExTaqTMⅡ試劑盒說明書。反應體系為SYBR?Premix ExTaqⅡ10 μL，PCR Forward Primer (10 μmol·L-1) 0.8 μL，PCR Reverse Primer (10 μmol·L-1) 0.8 μL，ROX 0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL。條件為95 ℃預變性10 s，95 ℃變性5 s，58 ℃退火及延伸25 s，共50 個循環。每個樣本每個基因重復3次。采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA的相對表達量。

1.5 數據分析

2 結 果

2.1 發病率及腹水心臟指數(AHI)

試驗觀察期間，21日齡時C組就出現有嚴重的腹水和心衰竭癥狀的模型雞。發病肉雞主要表現精神沉郁，冠髯發紫；下腹部明顯膨大，皮膚變薄發亮，觸摸有波動感，腹腔穿刺有體積30～200mL不等的淡黃色、枯黃色或淡紅色液體；剖解可見心臟肥大松軟，右心室擴張，心壁增厚，心包積液；肝淤血、腫大，呈紫紅色，部分雞在肝表面覆蓋有大量膠凍樣黃色滲出物；肺彌散性充血、水腫等。中藥組肉雞臨床癥狀被改善。表3結果表明，整個試驗過程中C組肉雞腹水綜合征累計發病率顯著高于N組(P<0.01)，T1、T2和L組發病率顯著低于C組(P<0.01)。

表3 肉雞腹水綜合征發病率

Table 3 Incidence of broilers AS %

N組C組T1組T2組T3組L組發病率Incidence3.8(2)28.8A(15)7.7B(4)11.3B(6)22.6(12)7.5B(4)

與N組對比，a.P<0.05，A.P<0.01；與C組對比，b.P<0.05，B.P<0.01；下同。括號內為該組發病個體數

Compared with group N，a.P<0.05，A.P<0.01；Compared with group C，b.P<0.05，B.P<0.01；The same as below.The number in bracket is individuals with AS in the corresponding group

表4結果表明，35日齡和45日齡時，C組肉雞AHI顯著高于N組(P<0.01)，T1、T2和L組AHI顯著低于C組(P<0.01)；45日齡各組AHI趨勢均高于35日齡。

2.2 肺組織NO和ET-1含量

表5結果表明，35日齡時，C組肺組織NO和ET-1含量顯著高于N組(P<0.05，P<0.01)，NO/ET-1比值顯著低于N組(P<0.01)；T1、T2和L組NO和ET-1含量顯著低于C組(P<0.05)，T1和L組的NO/ET-1比值顯著高于C組(P<0.05)。45日齡時，C組肺組織NO和ET-1含量顯著高于N組(P<0.01)，NO/ET-1比值顯著低于N組(P<0.01)；T1和L組ET-1含量顯著低于C組(P<0.05)，T1、T2和L組NO含量顯著低于C組(P<0.05)，T1和L組NO/ET-1比值顯著高于C組(P<0.05)。45日齡各組肺組織NO和ET-1含量趨勢均高于35日齡，NO/ET-1比值趨勢均低于35日齡。

2.3 肺組織NOS活性

表6結果說明，35日齡和45日齡時，C組肺組織cNOS活性顯著低于N組(P<0.01)，iNOS活性顯著高于N組(P<0.01)；T1和L組cNOS活性顯著高于C組(P<0.01，P<0.05)，T1、T2和L組iNOS顯著低于C組(P<0.01)。45日齡N和L組

組別Group35日齡35daysofage45日齡45daysofageNO/(μmol·L-1)ET-1/(ng·g-1)NO/ET-1NO/(μmol·L-1)ET-1/(ng·g-1)NO/ET-1N組1.532±0.1011.105±0.2731.360±0.3211.677±0.3161.446±0.1641.156±0.137C組1.736±0.066a1.743±0.182A1.013±0.060A1.793±0.048A1.997±0.209A0.908±0.107AT1組1.601±0.052b1.407±0.264b1.244±0.120b1.703±0.026b1.694±0.139b1.012±0.088bT2組1.593±0.034b1.512±0.108b1.091±0.0331.731±0.025b1.854±0.2600.953±0.150T3組1.723±0.0981.637±0.1821.081±0.0531.782±0.0221.937±0.2310.934±0.127L組1.624±0.092b1.379±0.162b1.216±0.085b1.704±0.024b1.708±0.148b1.005±0.098b

組別Group35日齡35daysofage45日齡45daysofagecNOSiNOScNOSiNOSN組0.3636±0.01640.2772±0.00820.4184±0.03780.3721±0.0120C組0.2696±0.0158A0.3397±0.0076A0.2019±0.0277A0.5064±0.0075AT1組0.3252±0.0182B0.3021±0.0081B0.3134±0.0270b0.4252±0.0114BT2組0.3071±0.01560.3265±0.0062B0.2546±0.02170.4738±0.0084BT3組0.2763±0.01710.3354±0.00940.2237±0.01250.4928±0.0087L組0.3333±0.0135B0.2923±0.0116B0.3431±0.0067b0.4034±0.0121B

肺組織cNOS活性趨勢較35日齡上升，其他組cNOS活性趨勢下降；45日齡各組iNOS活性均較35日齡趨勢上升。

2.4 肺組織ETARmRNA相對表達量

圖1結果表明，35日齡和45日齡時，C組肺組織ETARmRNA相對表達量顯著高于N組(P<0.01)；T1、T2和L組ETARmRNA相對表達量顯著低于C組(P<0.01)。45日齡各組ETARmRNA相對表達量均較35日齡趨勢升高。

圖1 肉雞肺組織ETAR mRNA 相對表達量Fig 1 Relative expression of ETAR mRNA in lung of broilers

3 討 論

快速生長的肉雞需要大量氧氣來滿足其生理需求，肉雞AS及PH的發生與缺氧密切相關[18]。缺氧狀態下，肺血管舒縮因子異常是形成PH的關鍵。NO和ET-1是調控血管舒縮狀態的一組生物活性因子。生理情況下，NO舒張血管，降低血壓，降低ET-1水平；ET-1收縮血管，升高血壓，促進NO釋放。NO和ET-1之間的相互作用決定血管最終的舒縮狀態。研究表明，缺氧狀態下，ET-1含量的絕對升高促進了PH的發生發展[19]，且引起NO的代償性升高[20]。本試驗中AS肉雞肺組織NO和ET-1含量均顯著升高、NO/ET-1比值顯著降低，NO和ET-1調節的血管舒縮功能失衡參與了AS病變，與文獻研究結果一致[21-22]，但也有研究表明，缺氧導致AS肺血管內皮細胞損傷，血管內皮舒張因子產生減少[15]，產生這種差別的具體機制尚待進一步研究。

NOS是合成NO的唯一關鍵限速酶，NO的含量與NOS活性變化直接相關[23]。NOS分為原生型(constitutive nitric oxide synthase，cNOS)和誘生型(inducible nitric oxide synthase，iNOS)；cNOS分為神經型(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)和內皮型(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)。本試驗結果表明，AS肉雞肺組織cNOS活性降低、iNOS活性升高，與汪雯翰等[24]研究結果一致，但也有研究得出相反結論[25]。研究表明，cNOS在生理條件下產生NO，與ET-1含量相平衡，保持血管狀態；iNOS于外界刺激后表達生成大量NO，表現出細胞毒作用[23]。缺氧引起的PH可導致體內cNOS mRNA表達量下降，iNOS表達量上升[26]。本試驗中，AS肉雞肺組織NO含量顯著升高，而肺組織cNOS活性降低、iNOS活性升高，說明肉雞長期處于刺激NO大量表達的狀態，導致組織損傷。

ET-1的縮血管功能通過ETAR特異性介導，ETAR在肺主要分布在肺血管和支氣管的平滑肌細胞上，介導血管和支氣管的收縮[27]。本試驗結果表明，AS肉雞肺組織ETARmRNA相對表達量增加，與相關研究結果一致[21，28]，缺氧促使內皮細胞合成分泌ET-1增加，ET-1調控并結合位于平滑肌細胞膜上的ETAR，介導血管收縮[29]，從而促進PH發展。

目前，以補益氣血、活血化瘀、滲濕利水類中藥組方防治AS的研究報道很多，主要從臨床癥狀、病理學檢查、體重、發病率、AHI、血液理化指標及抗氧化性能等方面進行檢測[30-32]，沒有從血管內皮舒縮活性因子NO與NOS、ET-1與ETAR進行系統研究的報道。鐘翠紅等[33]以黨參、黃芪、蒼術、陳皮、木通、赤芍、當歸、茯苓、甘草組方，表明中藥方劑能顯著升高AS肺NO含量，與本試驗結果不一致。本試驗結果表明，復方中藥能有效改善AS臨床癥狀，顯著降低發病率和AHI，以及AS肺組織NO、ET-1含量和ETARmRNA相對表達量，同時能夠升高肺組織cNOS活性，抑制iNOS活性升高，減輕NO細胞毒性，減少ET-1作用位點，阻滯其縮血管效應，恢復NO/ET-1比值，保護肺血管舒縮功能，從而有效防治AS，作用效果與L-Arg類似[34-35]，其功效與該方中藥配伍的協同作用及整體調節密切相關。

中獸醫學分析肉雞腹水綜合征的證候特征是氣血雙虛、氣血瘀滯、水濕停聚。氣血雙虛，則肝主疏泄、心主血脈、脾主運化、肺主氣主宣降、腎主水的功能失調，引發氣血瘀滯、水濕停聚。根據中獸醫治則，確立治法為補益氣血、行氣活血、利水滲濕；根據中藥藥性，黃芪益氣生精，固本補血；當歸補血行血，補虛通絡；丹參活血通經，祛瘀通脈；茯苓滲濕利竅，逐水化氣；大腹皮行氣導滯，利水消腫，故選配黃芪、當歸、丹參、茯苓、大腹皮等組成中藥復方。

研究表明，黃芪能夠降低缺氧引起的NO釋放增加，抑制NOS活性，保護血管[5]，還可緩解缺血引起的ET含量升高，舒張血管[6]；當歸能整體調節缺血組織的NOS活性和NO水平，干擾NO引起的細胞毒性作用[7]，有效成分阿魏酸鈉能抑制缺氧引起的ET-1含量升高，保護內皮細胞[8]；丹參可抑制NO的負性作用，調控NOS活性，保護內皮細胞[9]，而且能下調缺血及缺氧組織的ET水平[10]，優化NO/ET比例，保護組織[11]；茯苓主要成分茯苓酸可下調毒素誘導血管內皮分泌的NO和ET-1，使其含量接近正常水平[12]；大腹皮具有抑制毒素誘導iNOS活性的作用[13]。本試驗中，復方中藥能夠提高內皮源性NO水平，抑制iNOS合成大量NO造成的病理損害，抑制ET的合成分泌從而抑制血管收縮，降低肺動脈壓，從而有效防治AS。

中藥及復方中藥的多種活性成分單獨或協同作用于組織細胞的多種受體，通過多重信號通路整體調節機體功能，發揮其藥理作用。關于本試驗復方中藥對AS防治作用分子機制尚待進一步研究。

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(編輯 白永平)

The Effect and Mechanism of the Compound Recipe of the Traditional Chinese Medicine on NO，ET-1 in Lung of Broiler with Ascites Syndrome

HAN Ye-chen1#，SU Xiao-fei2#，WANG Jun-wu1，ZHANG Juan1，ZHU Yu-bo3，CHENG Jia1，YUN Shi-yu1，SUN Yao-gui1，WANG Wen-kui1，LI Hong-quan1，DUAN Zhi-bian1*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China；2.AnimalQuarantineStationofDaixianofShanxi，Daixian034200，China；3.CollegeofAnimalScinece，HenanInstituteofScienceandTechnology，Xinxiang453003，China)

The objective of this study was to investigate the changes of the contents of nitric oxide (NO) and endothelin-1 (ET-1)，and the related items in lung of broilers with ascites syndrome (AS) and the prevention and treatment of the compound recipe of the traditional Chinese medicine on AS.A total of 316 14-day-old Ross broilers were randomly divided into normal group (N，bred with a standard diet at room temperature)，control group (C，bred with high-energy diet derived from standard diet added with 3% lard and 4% fish meal and 0.12% Na+in drinking water at 9-11 ℃ to induce AS)，compound recipe of the traditional Chinese medicine groups (T1，T2，T3，bred in the same way as group C except a dose of 2，1，0.5 mL·kg-1bw of the traditional Chinese medicine everyday added in drinking water，respectively)，and L-arginine group (L，bred in the same way as group C except 1% L-arginine added in diet).The results showed that the broilers in group C presented the typical clinical symptoms of AS at 35 and 45 days of age.Compared with group N，the incidence of AS，ascites heart index (AHI)，the contents of NO and ET-1，iNOS activity and the relative expression amount ofETARmRNA in lung of broilers at 35 and 45 days of age in group C were increased significantly (P<0.01 orP<0.05)，and cNOS activity and the ratio of NO to ET-1 were decreased significantly (P<0.01) in group C.The clinical symptoms and items mentioned above were all improved in groups of L，T1 and T2 compared with group C (P<0.01 orP<0.05).The study showed that the increases of NO and ET-1 content，ETARmRNA relative expression amount and iNOS activity and the decrease of cNOS activity in lung of broiler induced the unbalance of NO and ET-1 which participated in the pathogenesis of AS.The studied compound recipe of the traditional Chinese medicine with the role of tonifying qi-blood and activating qi to excrete water can prevent and treat AS of broiler effectively.

compound recipe of the traditional Chinese medicine;ascites syndrome;nitric oxide;nitric oxide synthase；endothelin-1;endothelin A receptor

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.023

2015-01-13

山西省科技攻關項目(20140311022-1)；山西農業大學橫向科技項目(2013HX28)

韓燁晨(1992-)，女，黑龍江雙鴨山人，碩士生，主要從事中藥防治動物血管病變研究，E-mail：hanyechen1992@163.com；蘇曉菲(1989-)，女，山西忻州人，主要從事動物檢疫研究，E-mail：903451453@qq.com。韓燁晨和蘇曉菲同為第一作者

*通信作者：段智變(1969-)，女，山西祁縣人，博士，教授，博士生導師，主要從事中獸醫藥對動物血管病變及脾胃病證研究，E-mail：duanzhibian2008@aliyun.com

S853.33

A

0366-6964(2015)06-1055-08