雙峰駝天然重鏈抗體可變區酵母雙雜交文庫的構建與鑒定

胡湘云，高小龍，付向晶，劉丹丹，范文濤，王燕平，杜恩岐，王興龍，黨如意，楊增岐

(西北農林科技大學動物醫學院，楊凌 712100)

雙峰駝天然重鏈抗體可變區酵母雙雜交文庫的構建與鑒定

胡湘云，高小龍，付向晶，劉丹丹，范文濤，王燕平，杜恩岐，王興龍，黨如意，楊增岐*

(西北農林科技大學動物醫學院，楊凌 712100)

構建雙峰駝天然重鏈抗體可變區(VHH)酵母雙雜交文庫，并對文庫質量進行鑒定。采集未經免疫的6月齡雌性雙峰駝外周血、骨髓、脾和淋巴結，并從外周血中分離淋巴細胞。抽提總RNA，反轉錄為cDNA，用2對引物經過2輪PCR擴增得到400 bp左右的雙峰駝VHH片段。根據Clontech公司Mate & PlateTMlibrary construction system使用手冊，將帶有同源臂的VHH片段與線性化的pGADT7-Rec質粒共轉化Y187酵母感受態細胞，轉化產物涂布SD/-Leu平板，30 ℃倒置培養3～5 d后，收集平板上的所有克隆，即為雙峰駝天然重鏈抗體可變區酵母雙雜交文庫。對文庫的滴度、重組效率及多樣性進行鑒定。結果顯示，本研究構建的雙峰駝天然重鏈抗體可變區酵母雙雜交文庫庫容為2.07×107，滴度為7.6×108cfu·mL-1。隨機挑取47個獨立克隆進行菌落PCR鑒定，43個含有VHH片段，重組率為91.5%；選取其中19個測序，均為獨立克隆，且多樣性好。該研究成功構建雙峰駝天然重鏈抗體可變區酵母雙雜交文庫，且文庫質量滿足要求，為進一步獲得特定抗原的VHH奠定了基礎。

雙峰駝；重鏈抗體可變區；酵母雙雜交

重鏈抗體可變區(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH)是目前研究熱度最高的基因工程抗體之一[1-2]，其衍生于駱駝科動物和鯊魚體內天然存在的重鏈抗體，是目前發現天然存在的具有抗原結合功能的最小抗體片段，相對分子質量僅為15 ku，為傳統抗體的1/10[3-4]。由于VHH呈橢球形，高度僅為4.8 nm，直徑僅為2.2 nm，因此又被稱為納米抗體(nanobodies，Nbs)。相對傳統的單克隆抗體而言，VHH具有一些獨特的優點，如相對分子質量小，容易制造和表達，高水溶性且穩定性強，能識別隱蔽表位和酶的裂隙，可以表達成胞內抗體，具有較高的親和力及低免疫原性等[5-6]。上述特點使VHH在醫學診斷和治療以及蛋白質組學方面受到越來越高的重視[7-8]。

目前VHH的制備技術包括噬菌體展示技術、酵母展示技術和核糖體展示技術等，其中噬菌體展示技術最為常用[9-10]。噬菌體展示技術所構建的抗體庫可分為免疫文庫和非免疫文庫，非免疫文庫由于未經抗原刺激，所以抗體多樣性強于免疫庫，一旦構建完成，可用多種抗原進行篩選，避免了免疫動物這一繁瑣的環節，縮短了抗體制備時間，在新疫病快速診斷治療中更具優勢[8，11]。雖然噬菌體展示抗體庫技術應用廣泛，但其存在一定的缺陷，例如：噬菌體展示抗體庫使用原核表達系統將抗體展示在噬菌體表面，缺乏翻譯后修飾能力，可能會引起抗體活性降低，導致假陰性結果出現；同時其篩選過程是在體外進行的，不適合研究抗原抗體在細胞內反應活性。

利用酵母雙雜交抗體庫則可實現抗原抗體在真核細胞內表達與篩選，彌補了噬菌體展示抗體庫原核表達展示導致抗體活性降低這一缺陷，能更好地反映抗原抗體在體內反應的情況，并且避免了噬菌體抗體庫篩選前期抗原制備環節。因此，相對噬菌體展示抗體庫而言，酵母雙雜交抗體庫具有其獨特優勢[12]。X.Fu等學者構建了PCV2 VHH酵母雙雜交文庫，并成功篩選出了Cap蛋白的VHH[13]。但目前尚未見有關雙峰駝天然VHH酵母雙雜交文庫構建的報道。為此，本研究擬構建雙峰駝天然重鏈抗體可變區酵母雙雜交文庫，并對文庫質量進行評價，為后續篩選多種抗原的VHH奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑

Ficoll Paque PLUS購自Amersham Pharmacia Biotech；總RNA提取試劑盒(RNeasy?Plus Mini Kit)和膠回收試劑盒購自QIAGEN公司；2K plus DNA marker購自北京全式金生物技術有限公司；TaqDNA聚合酶、反轉錄試劑盒和DL2000 DNA marker購自TaKaRa公司；SD/-Leu選擇性培養基、YPDA培養基、50% PEG 3350、10×TE、10×LiAc、Yeastmaker Carrier DNA和3 mol·L-1醋酸鈉溶液等試劑均購自Clontech公司；DMSO、甘油購自Sigma公司；瓊脂糖購自Invitrogen公司；無水乙醇等其他試劑為國產分析純。

1.2 菌株及載體

Y187酵母菌和pGADT7-Rec線性化載體購自Clontech公司。

1.3 實驗動物

6月齡雌性雙峰駝，購于甘肅金昌。

1.4 引物設計

根據GenBank上收錄的VHH的核苷酸序列，設計了兩對引物用于擴增VHH片段。CALL01和CALL02為第一對引物，用以擴增大小分別為900 bp的VH-CH1-CH2片段和600 bp的VHH-CH2。VHH-up和VHH-down為第二對引物，用以從600 bp的VHH-CH2中擴增得到大小約為400 bp的VHH片段。T7和3′AD為pGADT7-Rec載體上的通用引物，用于文庫質量的PCR鑒定(表1)。引物由南京金斯瑞公司合成。

表1 文庫構建及鑒定所用引物

Table 1 Primers used for library construction and characterization

引物Primer核苷酸序列(5'-3')Primersequence(5'-3')CALL01GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGGCALL02GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCCVHH-upTTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGGAGTCTGGRGGAGGVHH-downGTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGGAGACGGTGACCWGGGTT7TAATACGACTCACTATAGGG3'ADAGATGGTGCACGATGCACAG

斜體部分為同源臂

Letters in italics is the homologous arms

1.5 樣品采集、淋巴細胞分離、總RNA的提取及反轉錄

雙峰駝安樂死后，無菌采集脾、淋巴結和骨髓，立即置液氮保存備用，之后用液氮進行研磨。頸靜脈采血，收集抗凝血與等體積磷酸緩沖液PBS(pH 7.4)混合，加入Ficoll Paque PLUS淋巴細胞分離液進行淋巴細胞分離。參照總RNA提取試劑盒說明書抽提淋巴細胞、脾、淋巴結和骨髓的總RNA，置于-80 ℃保存。以總RNA為模板，Oligo(dT)為引物，在M-MLV逆轉錄酶作用下反轉錄進行第一條鏈cDNA的合成，置于-20 ℃保存。

1.6VHH片段的擴增

以反轉錄的cDNA為模板，用引物CALL01和CALL02在TaqDNA聚合酶的作用下，進行第一輪PCR擴增。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，33個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，預期會出現大小為900和600 bp兩條帶。

切膠回收600 bp左右目的條帶，以此為模板，用引物VHH-Up和VHH-Down在TaqDNA聚合酶作用下進行第二輪PCR擴增獲取VHH片段，反應條件：95 ℃ 5 min；95℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，33個循環；72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的條帶，預期條帶大小400 bp。用膠回收試劑盒回收400 bp的VHH片段，并測定其濃度。

1.7VHH片段的濃縮

向回收的400 bpVHH片段中加入1/10體積3 mol·L-1醋酸鈉和2.5倍體積預冷的無水乙醇，用乙醇沉淀法對其進行濃縮。最后溶于20 μL滅菌水中，并測定濃度，使得濃縮后質量濃度達到2～5 μg·20 μL-1。

1.8 Y187感受態細胞的制備與轉化

根據Clontech公司Yeastmaker Yeast Transformation System 2的操作說明，進行Y187酵母感受態細胞的制備。依照Mate & PlateTMLibrary System使用手冊的操作說明和參考文獻[13]，進行VHH片段和pGADT7-Rec轉化Y187酵母感受態細胞。取轉化后的產物涂布80～100個150 mm SD/-Leu選擇性營養培養基平板，30 ℃培養3～5 d。

1.9 文庫菌的收獲

待平板上長出菌落后，置于4 ℃固化3～5 h；加入YPDA液體培養基(含25%甘油)，用已滅菌的涂菌棒刮取平板上的所有菌落，充分混勻后，置于-80 ℃保存備用。

1.10 雙峰駝VHH抗體庫的庫容量、滴度和多樣性鑒定

按照Mate & PlateTMLibrary System User Manual的操作說明采用梯度稀釋法，分別將轉化產物和文庫菌做倍比稀釋，涂布SD/-Leu選擇性營養培養基平板，30 ℃倒置培養3～5 d，計數各稀釋梯度平板上的菌落數，計算抗體庫的庫容和滴度。

隨機挑選SD/-Leu平板上長出的克隆以3′AD和T7為引物進行菌落PCR驗證。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分析文庫的重組率。隨機挑取菌落PCR呈陽性的PCR產物進行測序，分析文庫的多樣性。

2 結 果

2.1 淋巴細胞的分離及RNA提取

用淋巴細胞分離液從100 mL的外周血中最終分離到108個單核細胞。用RNA試劑盒抽提的RNA質量濃度為600 ng·μL-1，A260 nm/A280 nm值為2.01，滿足建庫需要。

2.2 VHH片段的擴增

使用2 μL總RNA(20 μL體系)作為模板，用M-MLV反轉錄酶進行cDNA的合成。以制備的cDNA為模板，用CALL01和CALL02為引物進行第一輪PCR反應擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1所示，出現兩條特異性條帶，大小分別為900和600 bp。

M.2K plus DNA相對分子質量標準；1～5.引物CALL01和CALL02擴增的PCR產物；6.陰性對照M.2K plus DNA marker；1-5.PCR products of primer CALL01 and CALL02；6.Negative control圖1 第一輪PCR產物瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of first round PCR products

回收第一輪PCR產物中600 bp的片段，以此為模板，用引物VHH-up和VHH-down進行第二輪PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2所示，出現一條與預期一致的400 bp的目的條帶，即為VHH片段。

M.DL2000 DNA相對分子質量標準；1-6.VHH PCR產物；7.陰性對照M.DNA marker DL2000；1-6.PCR products of VHH；7.Negative control圖2 第二輪PCR產物瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of second round PCR products

2.3VHH片段的濃度

400 bpVHH片段經膠回收和濃縮后，測得VHH片段質量濃度為220 ng·μL-1，滿足20 μL中含2～5 μg的建庫要求。

2.4 文庫的庫容量和多樣性鑒定

將濃縮的20 μL VHH片段和3 μg pGADT7-Rec共轉Y187酵母感受態細胞，轉化產物進行梯度稀釋后涂100 μL于SD/-Leu平板上，經計算文庫庫容量達2.07×107，滿足酵母雙雜交文庫構建要求。文庫菌進行梯度稀釋后涂布SD/-Leu平板，經計算文庫滴度為7.6×108cfu·mL-1。

從SD/-Leu平板上隨機挑取的47個克隆，用通用引物T7和3′AD進行菌落PCR鑒定，結果如圖3。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示隨機的47個克隆中有43個均為陽性克隆，抗體庫的重組率達91.5%，顯示文庫的插入率良好。

M.2K plus DNA相對分子質量標準；1～47.隨機挑選的菌落；48.陰性對照M.2K plus DNA marker；1-47.Randomly picked colonies；48.Negative control圖3 文庫菌落PCR鑒定Fig.3 Colony PCR identification results

隨機挑選19個菌落PCR呈陽性的PCR產物進行測序，測序結果與NCBI發表的VHH進行Blast比對分析，結果顯示這些序列與駱駝屬的重鏈抗體重鏈可變區高度同源，均為VHH。用Clone Manager軟件對19個序列進行相互比對，結果如圖4，顯示此19個VHH序列均為獨立克隆，且在FR1區22位、FR3區102位特定位置均含有半胱氨酸，FR2區37、44、45、47位的氨基酸堿基由疏水性堿基變為親水性堿基，符合納米抗體的結構特征，表明抗體庫多樣性較好。19個序列的GenBank登錄號為RF179360～179383。

“.”表明與第一行序列相同的序列，不同的序列由陰影區表示，“-”表明缺失的序列，FR1、FR3區實線圖框內為半胱氨酸殘基，FR2區虛線圖框內為納米抗體4個保守的特有的親水性堿基The dots denote the same sequences compared with VHH1，differences in the sequence are shadowed，and the dash shows the missing sequences.The hallmark Cys residues in FR1 and FR3 are denoted by the thick-line boxes.The four conservative hallmark residues of VHH in FR2 are denoted by the dotted line boxes.圖4 19個VHH片段的氨基酸序列分析Fig.4 Amino acids sequence alignment of 19 VHH antibody fragments

3 討 論

針對目前在疾病治療和蛋白質功能研究上面臨的缺少能在細胞內發揮功能的抗體的這一難題，作者以VHH作為突破口。相對于常規的單鏈抗體(single chain of variable fragment，scFv)而言，VHH作為一種基于重鏈抗體的新型抗體，可在真核細胞內更好地正確折疊，且可溶性強、表達量大[14]。當前VHH的主流篩選技術為噬菌體展示技術，如前文所述，其存在難以規避的缺陷，而酵母雙雜交技術則彌補了這一缺陷。鑒于此點，作者選用酵母雙雜交技術構建VHH文庫以進行抗體篩選。

文庫構建中為了避免VH基因的干擾，作者采取2輪PCR獲得VHH[15]。第一輪PCR以CALL01和CALL02為引物成功擴增出約900 bp的VH-CH1-CH2和600 bp的VHH-CH2。第二輪PCR以回收的600 bpVHH-CH2為模板，用引物VHH-up和VHH-down成功擴增VHHFR1到FR4之間的區段，并通過引物上所帶同源臂克隆至pGADT7-Rec載體上，隨機挑取的19個克隆測序結果顯示均符合VHH特征。

文庫庫容和多樣性是文庫質量評價的重要指標。本研究采用Clontech公司酵母雙雜交技術，通過線性化載體與目的基因末端同源序列，利用同源重組將VHHs序列克隆到載體中，避免了傳統酶切和連接這一步驟，簡化了操作流程；用PEG/LiAC法進行轉化，轉化效率可達4.14×106cfu·3 μg-1。從轉化后的平板隨機挑選克隆進行菌落PCR鑒定，結果顯示納米抗體酵母文庫的插入重組率可達91.5%。高的轉化效率和重組率保證了最終的文庫庫容為2.07×107。隨機挑取19個克隆進行測序分析，結果顯示均為獨立克隆，在FR1區第22位和FR3區第102位堿基均含半胱氨酸殘基，并且在FR2區上4個位點的氨基酸殘基滿足Val37Phe/Tyr、Gly44Glu、Leu 45Arg/Cys/His、Trp47Gly/Leu/Glu的特征，與之前關于VHH特征序列的報道相符[16]；表明文庫多樣性良好。同時FR1區和FR3區的半胱氨酸可穩定長的CDR3區形成的大凸環結構，以便能很好的識別空間構象上的裂隙和空腔結構，37、44、45、47位存在特征性的氨基酸殘基替換使得VHH溶解性增強[16]。

綜上所述，本研究成功構建了雙峰駝天然重鏈抗體可變區酵母雙雜交文庫，并對文庫滴度、重組率及序列多樣性進行鑒定，為進一步篩選特定抗原的VHH奠定基礎。

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(編輯 白永平)

Construction and Characterization of a NaiveCamelusBactrianusVariable Domain of Heavy Chain of Heavy-Chain Antibody(VHH)Yeast Two-Hybrid Library

HU Xiang-yun ，GAO Xiao-long，FU Xiang-jing，LIU Dan-dan，FAN Wen-tao，WANG Yan-ping，DU En-qi，WANG Xing-long，DANG Ru-yi，YANG Zeng-qi*

(CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China)

The aim of this study was to construct and characterize of a naiveCamelusbactrianusvariable domain of heavy chain of heavy-chain antibody(VHH)yeast two-hybrid library.The blood，bone marrow，spleen and lymph node were collected from a healthy non-immunized 6 month-old femaleCamelusBactrianus. And peripheral lymphocytes were isolated from blood samples using Ficoll Paque PLUS reagent.Then total RNA was extracted from peripheral lymphocytes，bone marrow，spleen and Lymph nodes.Reverse-transcription was performed to generate the first-stand cDNA.VHH fragments were amplified through two rounds PCR using two pairs of specific primers.NaiveCamelusBactrianusVHH yeast two-hybrid library was successfully constructed according to Clontech Mate & Plate library construction system user manual.Briefly，5 μg VHHs fragment containing homologous arms in 20 μL were co-transformed with 6 μL linearized pGADT7-Rec plasmid into component Y187 yeast cells，and transformation products were plated on SD/-Leu plates.After 3-5 days incubation at 30 °C，the library was harvested and the library quality were evaluated by titer，recombination efficiency，diversity and complexity.The results showed that there were 2.07×107independent clones in the naive VHH yeast two-hybrid library and the library titer was 7.6×108cfu·mL-1.PCR results showed that 43 independent clones inserted VHHs fragment in 47 randomly picked out clones，and the recombination efficiency was 91.5%.Nineteen independent clones were random picked out to sequence and sequence results indicate they all share unique sequences.In a conclusion，a naiveCamelusBactrianusvariable domain of heavy chain of heavy-chain antibody yeast two-hybrid library was successfully constructed with large capacity，good diversity and complexity，which laid the foundation for preparation VHHs against interested antigens.

Camelusbactrianus；variable domain of heavy chain of heavy chain antibody (VHH)；yeast two-hybrid system

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.025

2014-09-26

國家自然科學基金(31272578)；西北農林科技大學引進人才科研啟動基金(Z111021006)

胡湘云(1990-)，女，廣西南寧人，碩士，主要從事動物傳染病和基因工程抗體的研究，E-mail：821995274@163.com

*通信作者：楊增岐，教授，E-mail：yzq8162@163.com

Q789

A

0366-6964(2015)06-1071-06