單核細胞增生李斯特菌非編碼RNA rli87基因缺失株的構建、鑒定及其生長特性初步研究

謝 堃，喬 軍*，孟慶玲，彭葉龍，趙海龍，馬 玉，陳 誠，才學鵬，陳創夫

(1.石河子大學動物科技學院，動物疾病防控兵團重點實驗室，石河子 832003；2.中國農業科學院蘭州獸醫研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，蘭州 730046 )

單核細胞增生李斯特菌非編碼RNArli87基因缺失株的構建、鑒定及其生長特性初步研究

謝 堃1，喬 軍1*，孟慶玲1，彭葉龍1，趙海龍1，馬 玉1，陳 誠1，才學鵬2，陳創夫1

(1.石河子大學動物科技學院，動物疾病防控兵團重點實驗室，石河子 832003；2.中國農業科學院蘭州獸醫研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，蘭州 730046 )

擬構建單核細胞增生李斯特菌(LM)非編碼RNArli87基因缺失株，對其進行分子鑒定，分析rli87基因缺失對LM生長的影響。用融合PCR方法構建LM-SB5rli87基因缺失突變體，并構建pKSV7-Δrli87穿梭載體，將其轉化入LM-SB5感受態細胞，利用溫度(42 ℃)和氯霉素(10 μg·mL-1)的抗性雙重壓力來實現同源重組，篩選同源重組菌進行分子鑒定，測定缺失株與母源野毒株37 ℃條件下生長曲線。結果顯示：PCR和測序結果證實成功獲得了LM-Δrli87重組菌。通過25代的連續傳代，PCR鑒定結果顯示，該缺失株具有良好的遺傳穩定性。與野毒株進行對比，在37 ℃條件下缺失株與野毒株的生長差異不顯著(P>0.05)。非編碼RNArli87基因在37 ℃條件下對LM生長沒有明顯的調控作用。

rli87基因；LM感受態細胞；缺失株；生長特性；同源重組

單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)是一種兼性胞內寄生的革蘭陽性致病菌，生存能力強，存在范圍廣[1]。LM主要通過消化道引起動物和人的急性感染，對畜牧業和人類健康造成了巨大的威脅，因此，LM被WHO列為四大食源性致病菌之一[2-3]。

在LM感染宿主的過程中需要眾多的毒力因子參與。參與LM侵染和胞內寄生生活相關的毒力基因主要集中在LM致病島1(LIPI-1)和致病島2(LIPI-2) 2個區域中。LIPI-1含有6個基因，依次為prfA、plcA、hly、mpl、actA、plcB；LIP-2又稱為內化素小島，主要編碼一些小分子的內化素[4-5]。近年來大量研究發現，LM非編碼ncRNA在調控其生長、基因表達、糖代謝、金屬離子轉運、生物膜形成、胞內寄生及環境應激過程中也扮演著重要的角色，其調控模式已經成為LM調控網絡中的最重要作用方式之一[6]。根據ncRNAs的調控機制，LM ncRNAs可以分為3種：順式作用RNA(cis-acting RNAs，如核糖開關)、反義RNA(anti-sense RNAs，asRNAs)和反式編碼的小RNA(trans-encoded small RNAs，sRNAs)。順式作用RNA位于mRNA的5'端非編碼區(5'-UTR)或 3'端非編碼區(3'-UTR)，既可以影響細菌的翻譯，也可影響轉錄，還可以影響到mRNA的穩定性和折疊結構[7-8]。研究發現，sRNA通過與目的mRNA上短的、不連續的、互補的區域堿基互補配對來發揮作用，并且一種sRNA可以與多種mRNA相互作用。sRNA能夠抑制也能夠激活目的mRNA的翻譯，同時sRNA與目的mRNA頻繁的結合會導致mRNA被RNases快速的降解[9]。本研究用RNAStructure5.0生物信息學軟件對rli87二級結構進行預測分析，結果發現在其二級結構中存在三個莖環結構，通過進一步對比分析發現環上的序列與LM毒力島Ⅰ、毒力島Ⅱ上的獨立基因及環境應激相關基因具有多個位點的非連續互補配對序列，因此推測rli87可能通過調節環境應激基因的表達在LM毒力及環境應激過程中發揮著調控作用。rli87基因屬于sRNA，然而目前有關rli87基因的生物學功能尚不清楚。本研究應用同源重組技術構建rli87基因缺失株LM-Δrli87，研究rli87缺失對LM生長的影響，以期為進一步揭示rli87在LM致病性和環境應激能力的調控作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體及試劑

LM-SB5野毒株由石河子大學動物科技學院分離，分離自發病綿羊腦組織，經分子生物學鑒定后由石河子大學新疆地方與民族高發病教育部重點實驗室保存。TaqplusDNA聚合酶、Pfu DNA Polymerase、dNTPs、瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒購自上海生物工程公司。T4 DNA連接酶、DNA Marker、pMD19-T載體購自大連TaKaRa公司。細菌基因組提取試劑盒購自諾維森公司。限制性核酸內切酶(KpnⅠ、PstⅠ)購自Promega公司，pKSV7穿梭質粒由揚州大學朱國強博士饋贈。

1.2 引物設計

根據GenBank登錄的LM-EGD基因組序列(登錄號：AL591824)，用DNAMAN軟件進行同源性分析，選擇保守區域，用Primer 5.0軟件設計擴增上游同源臂引物P1-P2，下游同源臂引物P3-P4。融合PCR的引物為P1-P4，全長1 095 bp。在P1-P4 引物的5′端加酶切位點和保護性堿基。設計檢測引物P5-P6，全長584 bp(表1)。引物由上海生物工程公司合成。

1.3Δrli87基因缺失融合片段的構建

提取LM-SB5株基因組，先用引物P1-P2 和P3-P4分別擴增上、下游同源臂，然后以P1-P4為引物，用SOE-PCR技術融合上、下游同源臂。先用Pfu DNA Polymerase對上、下游同源臂互補延伸10個循環，再加入P1-P4引物各0.4 μL擴增融合片段的全長。采用20 μL反應體系(上、下游同源臂各2 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL、2.5 dNTPs 2 μL，水11.2 μL，Pfu DNA Polymerase 0.3 μL)。反應條件：96 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，64 ℃退火40 s，72 ℃延伸3 min，30個循環；72 ℃延伸10 min，得到Δrli87基因缺失的融合片段?；厥杖诤掀危cpMD19-T載體連接，用PCR和酶切方法篩選pMD19-T-Δrli87重組質粒。

1.4 pKSV7-Δrli87穿梭質粒的構建

將pMD19-T-Δrli87和pKSV7質粒分別用KpnⅠ、PstⅠ雙酶切，酶切后分別回收條帶。將酶切回收的融合片段與pKSV7質粒于4 ℃冰箱連接過夜，獲得陽性轉化子，用PCR和酶切方法驗證pKSV7-Δrli87質粒。

表1 本研究中用到的PCR引物

Table 1 PCR primers used in this study

引物Primers序列(5'-3')Sequence產物/bpAmplifiedlengthsP1P2GGGGTACCAACTTAGACAAGATGACGCAGCCAACATTTATTAACAAAATCTGTTATAGTTCTTCTGCAACCC518P3P4GGGTTGCAGAAGAACTATAACAGATTTTGTTAATAAATGTTGGAACTGCAGACTCTATCTCGCAATGTAAGC577P5P6AGAACTAGTGGTTTTCCCCAAATAAATACGCACATC584

1.5 LM-Δrli87缺失株的構建、篩選與鑒定

按文獻[6]制備LM感受態細胞。取100 μL感受態細胞加入8 μL pKSV7-Δrli87質粒，進行電轉化，電轉條件：2.5 kV·cm-1、0.5 ms。電轉化后，冰浴10 min，向電擊杯中加入800 μL BHI液體培養基，37 ℃振蕩培養(200 r·min-1)3 h。將電轉后的菌液涂在含有氯霉素(10 μg·mL-1)的BHI固體培養基上，通過PCR鑒定獲得的陽性菌；在氯霉素抗性(10 μg·mL-1)的BHI液體培養基、42 ℃條件下傳代，以P5-P6為引物進行PCR擴增，并將擴增產物送至華大基因公司進行測序。

1.6 LM-Δrli87缺失株遺傳穩定性的檢測

將構建的LM-Δrli87接種在BHI液體培養基中，于37 ℃恒溫搖床連續培養傳25代，提取缺失株的基因組DNA，用引物P5-P6做PCR擴增，檢測LM-Δrli87缺失株遺傳穩定性。

1.7 LM-Δrli87缺失株生長特性初步研究

將野毒株SB5和缺失株LM-Δrli87在平板上劃線培養，然后挑取單菌落分別接種在10 mL BHI液體培養基中，在37 ℃ 180 r·min-1條件下培養12 h，OD600 nm≈0.6時，將野毒株和缺失株菌液以1∶100的比例接入BHI液體培養基，于37 ℃ 180 r·min-1條件下培養，每2 h從培養液中吸取菌液200 μL，測定不同時間點OD600 nm值，繪制生長曲線，進行比較分析。

2 結 果

2.1 目的基因的擴增

以LM SB5基因組為模板，P1-P2引物擴增得到了大小與預期518 bp相符的上游同源臂；P3-P4 引物擴增得到了大小與預期577 bp相符的下游同源臂(圖1)。用P1-P4引物對上、下游同源臂進行融合擴增，結果擴增的融合片段與預期的1 095 bp相符(圖2)。pMD19-T-Δrli87重組質粒PCR和酶切鑒定均正確，目的條帶為1 095 bp(圖3)。

M.DL2000 DNA相對分子質量標準;1.上、下游同源臂產物；2.陰性對照；3.下游同源臂產物;4.上游同源臂產物M.DL2000 DNA marker;1.The product of upstream and downstream homologous arms;2.Negative control;3.The downstream homologous arm products;4.The upstream homologous arm products圖1 同源臂基因的PCR擴增Fig.1 Homology arm gene amplified by PCR

M.DL2000 DNA相對分子質量標準；1、2、4、5、7、8.擴增產物M.DL2000 DNA marker；1,2,4,5,7,8.The amplification products圖2 重疊延伸PCR的擴增產物Fig.2 Amplification products by overlap extension

M.DL5000 DNA相對分子質量標準；1～4.酶切產物M.DL5000 DNA marker；1-4.The products from pMD19-T-Δrli87圖3 pMD19-T-Δrli87的酶切鑒定Fig.3 Identification of pMD19-T-Δrli87 by enzyme digestion

2.2 pKSV7-Δrli87質粒的鑒定

pKSV7-Δrli87質粒轉化入E.coliDH5α感受態細胞，獲得陽性菌，做菌液PCR檢測，提取陽性菌的質粒，PstⅠ、KpnⅠ對質粒同步雙酶切。酶切產物電泳檢測結果與預期片段1 095 bp相符(圖4)。

M.DL5000 DNA相對分子質量標準；3～7.雙酶切產物M.DL5000 DNA marker；3-7.The products from pKSV7-Δrli87圖4 pKSV7-Δrli87的酶切鑒定Fig.4 Identification of pKSV7-Δrli87 by enzyme digestion

2.3 LM-Δrli87缺失株的PCR鑒定

用引物P5和P6對疑為重組缺失菌株進行PCR擴增鑒定。未重組的LM擴增的產物為783 bp，而重組的為584 bp，電泳結果顯示與預期結果相符(圖5)。584 bp片段測序后發現，已經缺失了rli87基因，表明已經成功構建了重組LM-Δrli87菌株。

2.4 LM-Δrli87缺失株遺傳穩定性鑒定

連續傳代25代后的缺失株PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，缺失菌株產物為584 bp的條帶，與預期結果相符，說明缺失株在BHI中穩定傳代，缺失株具有很好的遺傳穩定性。(圖6)。

M.DNA相對分子質量標準;1～5.重組菌的PCR產物;6.SB5陰性對照.M.DL2000 DNA marker;1-5.PCR products;6.Negative control圖5 LM-Δrli87重組菌的PCR鑒定Fig.5 PCR identification of recombinant LM-Δrli87

M.DNA相對分子質量標準;1～10.重組菌PCR產物M.DL2000 DNA marker;1-10.The PCR products圖6 LM-Δrli87重組菌遺傳穩定性PCR鑒定Fig.6 Identification of genetic stability of recombinant LM-Δrli87 by PCR

2.5 LM-Δrli87缺失株生長特性

圖7是野毒株和缺失株在37 ℃溫度條件下的生長情況。在37 ℃條件下，野毒株和缺失株培養差異不顯著(P>0.05)，表明rli87基因在37 ℃條件下對LM的生長速度沒有明顯的調控作用。

圖7 LM-Δrli87和LM-EGD菌株在37 ℃條件下的生長曲線Fig.7 Growth curves of LM-Δrli87 and LM-EGD at 37 ℃

3 討 論

迄今為止，在李斯特菌中已被證實的sRNA有113個，其中有88個同時存在于致病性李斯特菌與非致病性李斯特菌，25個只存在于LM中。S.Sievers等對依賴于伴侶分子蛋白Hfq的ncRNA LhrC 進行了研究，構建了LhrC基因缺失株，通過與母源株比較，證實LM ncRNA LhrC在0.07%膽酸鹽環境應激中扮演了重要角色[10]。雖然對于sRNAs功能的研究數據有限，最近一些sRNAs，包括rliB、rli31、rli33-1和rli50被證明在細菌毒力和細菌生長的過程中發揮了調控作用[11]。越來越多的研究還發現，ncRNA 在LM生長、蔗糖代謝、群體感應和毒力等方面可能發揮了重要的調控作用[12]，其調控模式已經成為LM調控網絡中最重要的作用方式之一。

同源重組(homologous recombination)是將外源基因定位導入受體細胞染色體上的方法，因為在該座位有與導入基因同源的序列，通過單一或雙交換，新基因片段可替換有缺陷的基因片段，達到修正缺陷基因的目的[13-14]。位點特異性重組是發生在兩條DNA鏈特異位點上的重組，重組的發生需一段同源序列(即特異性位點，又稱附著點，attachment site，att)和位點特異性的蛋白因子(即重組酶)參與催化[15]。重組酶僅能催化特異性位點間的重組，因而重組具有特異性和高度保守性。研究證實，在同源重組的染色體整合中，同源片段越長，整合頻率越高，通常情況下，大于300 bp的同源片段可有效實現同源重組[16]。因此，本研究擴增了rli87基因上游和下游共584 bp的基因序列作為同源片段，從而提高外源基因在LM染色體中的整合效率。同時在引物序列中引入2個酶切位點(KpnⅠ、PstⅠ)，作為同源重組載體的多克隆位點，可根據研究的需要插入目的基因在LM染色體上進行同源重組。

將質粒轉入宿主菌胞內是構建缺失株的重要環節之一。目前，實驗室中最常用的轉化方法有熱擊法、原生質體轉化法和電穿孔法。對于LM這樣的革蘭陽性菌，由于細菌細胞壁較厚，熱擊法很難對其起作用，因此轉化常用電穿孔法，且電穿孔法便于使用[17-18]。然而，質粒的濃度、電壓、感受態細胞的特性、緩沖液的濃度等都是影響電轉化效率的重要因素。感受態細胞的細菌濃度在一定規范內，細菌濃度越高，轉化效率就越高，兩者呈正相關。電場強度是影響電轉化效率的主要因素，時間太短或太長均會使轉化效率降低[6，19]。在本研究的電轉試驗中，對于電轉的條件進行了大量的摸索，獲得具有良好遺傳穩定性的LM-Δrli87。

本研究運用RNAStructure 5.0生物信息學軟件對rli87二級結構進行預測分析，結果發現在其二級結構中存在三個莖環結構，通過進一步對比分析發現環上的序列與LM毒力島Ⅰ、毒力島Ⅱ上的毒力基因及環境適應因子具有多個位點的非連續互補配對序列，因此推測rli87可能通過調控環境適應因子相關基因的表達在LM不同環境應激過程有著調控影響。通過對比缺失株和野毒株的生長曲線，結果發現在37 ℃條件下，兩株菌的生長情況沒有顯著差異，提示rli87基因在37 ℃條件下對LM的生長情況沒有明顯的調控作用。有關rli87在LM環境適應及毒力調控中的作用，尚需進一步研究。

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(編輯 白永平)

Construction，Identification of ncRNArli87 Gene Deletion StrainsListeriamonocytogenesand Its Growth Characteristics

XIE Kun1，QIAO Jun1*，MENG Qing-ling1，PENG Ye-long1，ZHAO Hai-long1，MA Yu1，CHEN Cheng1，CAI Xue-peng2，CHEN Chuang-fu1

(1.KeyLaboratoryofPreventionandControlofAnimalDisease，CollegeofAnimalScienceandTechnology，ShiheziUniversity，Shihezi832003，China；2.KeyLaboratoryofNationalVeterinaryEtiologicalBiology，LanzhouVeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Lanzhou730046，China)

In this study，non-coding RNArli87 gene deletion strain of LM was constructed and identified，and growth characteristics of deletion strain was studied.Therli87 gene deletion mutant was constructed by fusion PCR method，and then pKSV7-Δrli87 shuttle vector was constructed，which was transformed into competent cells LM-SB5.Homologous recombination was conducted using temperature (42 ℃) and chloramphenicol (10 μg·mL-1) resistance to achieve therli87 gene deletion strain，and growth curves of wild strain and deletion strain were assayed at 37 ℃.The PCR and sequencing results confirmed that LM-Δrli87 was successfully obtained.PCR identification results showed that the deletion strain has good genetic stability through 25 generations of continuous passage.Comparison with the wild strain，there was no significant difference (P>0.05) in growth between deletion mutant and wild strain at 37 ℃.The results suggest thatrli87 gene did not play significant role in regulatory growth under the conditions of 37 ℃.

rli87 gene；Listeriamonocytogenes；deletion strain；growth characteristics；homologous recombination

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.016

2014-09-01

國家國際科技合作專項(2014DFR31310)；國家自然科學基金(30960274；31360596)

謝 堃(1990-)，女，碩士生，主要從事病原分子生物學研究，E-mail：xiekuns@gmail.com

*通信作者：喬 軍，Tel：+86-993-2055036；E-mail：qj710625@163.com

S852.61

A

0366-6964(2015)06-0998-06