沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細胞增殖及IL-2、IL-4、IFN-γ mRNA表達的影響

薩茹麗，木其爾，王翠芳，包玲玲，敖長金*，王思珍

(1.內蒙古農業大學動物科學學院，呼和浩特 010018； 2.內蒙古民族大學動物科學與技術學院，通遼 028000)

沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細胞增殖及IL-2、IL-4、IFN-γmRNA表達的影響

薩茹麗1，木其爾1，王翠芳1，包玲玲1，敖長金1*，王思珍2

(1.內蒙古農業大學動物科學學院，呼和浩特 010018； 2.內蒙古民族大學動物科學與技術學院，通遼 028000)

本試驗以綿羊外周血淋巴細胞為研究對象，研究沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細胞增殖率，IL-2、IL-4、IFN-γ基因mRNA表達量的影響，為全面揭示沙蔥黃酮的免疫調節活性機制和相關產品的開發提供試驗依據。試驗采用MTT法研究沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細胞增殖率的影響，使用RT-PCR法研究沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細胞IL-2、IL-4、IFN-γ基因mRNA表達量的影響。結果顯示，沙蔥黃酮具有促進綿羊外周血淋巴細胞增殖的作用，對綿羊外周血淋巴細胞IL-2 mRNA表達無明顯調節作用，可上調IFN-γmRNA表達，下調IL-4 mRNA表達。綜上，沙蔥黃酮具有促進綿羊外周血淋巴細胞增殖及免疫調節活性的作用。

沙蔥黃酮；淋巴細胞增殖；IL-2；IL-4；IFN-γ

沙蔥又名蒙古韭，主要生長于我國西北部荒漠化草原，是一種抗寒抗旱能力極強的百合科蔥屬植物[1]。研究表明，沙蔥及其提取物在抗氧化[2-3]、抗菌及提高畜產品品質[4-5]、改善家畜免疫機能[6-7]等方面具有較好的生物功效。沙蔥黃酮(AlliumMongolicumRegelFlavonoids，AMF)是由沙蔥嫩葉中分離得到的一種天然植物提取物[8]。趙春艷等研究表明，沙蔥黃酮具有較好的抗氧化活性[9]及免疫調節活性[10]。

本試驗欲通過體外試驗觀察沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細胞增殖率的影響，并使用實時熒光定量PCR方法測定沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細胞IL-2、IL-4、IFN-γmRNA表達的影響，旨在為沙蔥黃酮類化合物的深入研究與相關產品的開發提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

沙蔥黃酮參照文獻[6]報道的方法由本實驗室自制。

羊外周血淋巴細胞分離液為天津市灝洋生物制品科技有限責任公司生產；胎牛血清、RPMI-1640為Gibico公司生產；四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、β-巰基乙醇、刀豆蛋白A(ConA)等均為Sigma公司產品；磷酸鹽緩沖液(PBS)為Hyclone 公司生產；RNA iso plus(D9108B)、SYBR@Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(DRR820A)、Prime Script@RT Master Mix Perfect Real Time (DRR036S)、DL2000 DNA Marker(D501A)、DL500 DNA Marker(D525A)、pMD 19-T Vector(D102A)等均購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 主要儀器

HEPA class 100 CO2培養箱；BIOTEK Synergy H4型全自動多功能酶標儀；ESCO AC2-4S1生物安全柜；Olympus IX71倒置相差顯微鏡；Nikon YS100普通光學顯微鏡公司；Bio-Rad iQ5 Multicolor 熒光定量PCR儀；TGRADIENT梯度PCR儀等。

1.3 試驗方法

1.3.1 綿羊外周血淋巴細胞的分離及培養 參照文獻[11]的方法，無菌采集健康蒙古綿羊頸靜脈血，血液采用肝素鈉抗凝。1 500 r·min-1離心10 min后去除血清，將血漿與PBS等比例混勻，取5 mL緩慢鋪在分裝于玻璃離心管的羊淋巴細胞分離液(4 mL)上，3 000 r·min-1離心40 min，中間白色霧狀層即為綿羊外周血單個核細胞(PBMC)層，取PBMC用PBS洗滌兩次，加入含10% FBS的RPMI-1640細胞培養液，37 ℃、5% CO2條件下培養4 h，收集未貼壁細胞并重懸于RPMI-1640細胞培養液中，即得到綿羊外周血淋巴細胞。經臺盼藍染色，確定細胞存活率>95%后，調整細胞濃度至1×107個·mL-1，于37 ℃、5% CO2條件下培養24 h，用于后續試驗。

1.3.2 沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細胞增殖率的影響 試驗分為對照組和試驗組，對照組為50 μL綿羊外周血淋巴細胞懸液加入50 μL細胞培養液；試驗組分為高、中、低計量組，分別為50 μL綿羊外周血淋巴細胞懸液加入50 μL含不同濃度沙蔥黃酮的細胞培養液(10 mg沙蔥黃酮溶于10 mL RPMI-1640中，0.22 μm濾器過濾除菌后分別稀釋至200、100、50 μg·mL-1)于96孔U型細胞培養板中，每個處理5個重復，37 ℃、5% CO2條件下分別培養6、12、24、48 h。培養結束前4 h，每孔加入5 mg·mL-1的MTT溶液20 μL，培養結束后用平板離心機2 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩搖勻后570 nm處測定各孔吸光度值。

1.3.3 沙蔥總黃酮對綿羊外周血淋巴細胞IL-2、IL-4及IFN-γmRNA表達的影響

1.3.3.1 試驗分組與細胞處理：試驗分為對照組與試驗組，對照組為1 mL綿羊外周血淋巴細胞懸液加入1 mL細胞培養液；試驗組分為高、中、低劑量組，分別為1 mL綿羊外周血淋巴細胞懸液加入1 mL不同濃度沙蔥黃酮的細胞培養液(10 mg沙蔥黃酮溶于10 mL RPMI-1640中，0.22 μm濾器過濾除菌后分別稀釋至200、100、50 μg·mL-1)。按試驗分組要求將各組細胞接種于6孔細胞培養板中，每孔2 mL，每個處理5個重復，于37 ℃、5% CO2條件下培養24 h后將細胞轉入無菌離心管中，1 500 r·min-1離心10 min，收集沉淀。在所得細胞沉淀中加入4 mL PBS反復吹打混勻后1 500 r·min-1離心10 min，去掉上清，收集沉淀(此步驟重復2～3次)。

1.3.3.2 總RNA的提取：按照RNA提取試劑盒操作說明書進行總RNA提取。提取所得細胞總RNA樣品使用Synergy H4多功能酶標儀測定其 A260 nm/A280 nm值，選擇A260 nm/A280 nm值為1.8～2.2的樣品進行后續試驗或凍存于-80 ℃冰箱內備用。

1.3.3.3 反轉錄反應：按照反轉錄試劑盒說明書并結合趙飛艷等[12]報道方法進行。

1.3.3.4 引物合成：β-actin、IL-2、IL-4、IFN-γ基因引物序列同趙飛艷等[12]所報道引物序列一致，由大連寶生物公司合成(表1)。

1.3.3.5 實時熒光定量PCR反應：用iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System對綿羊外周血淋巴細胞的cDNA進行熒光定量PCR反應，反應液的組分與配制見表2。β-actin、IL-2、IL-4與IFN-γ基因的反應程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。

表1 引物序列及產物長度

Table 1 Primers sequence and product size

引物名稱Primername引物序列(5'-3')Primersequence產物大小/bpProductsizeβ-actinforwardβ-actinreverseIL-2forwardIL-2reverseIL-4forwardIL-4reverseIFN-γforwardIFN-γreverseCCCATTGAGCACGGCATTGCAGGGGTGTTGAAGGTCTCTGTCTTGCATTGCACTAACTCTTGTTCTTTCATTGTGTTCCCCGTAGAATTGAGCTTAGGCGTATCTACAGGTACTCGTCTTGGCTTCATTCACAAATCTAACCTCAGAAAGCGGAAGAGCAGGCAGGAGAACCATTAC1858012281

表2 實時熒光定量PCR的反應液的組分與配制

Table 2 The component of quantitative PCR reaction solution

試劑Reagents使用量/μLUsageamountSYBRPremixEXTaqTMⅡ(2×)12.5PCRForwardPrimer(10μmol·L-1)1.0PCRReversePrimer(10μmol·L-1)1.0cDNA2.0ddH2O8.5Total25.0

1.3.3.6 基因 mRNA 表達水平相對定量與分析：本試驗采用比較閾值法對目的基因進行相對定量分析[13]。反應結束后系統自動將熒光信號強度轉化為基因的Ct值，統計時對每個基因的3個重復取平均值記為Ct 值。目的基因的相對表達量可以根據公式進行計算：2-ΔΔCt=2-[(試驗組目的基因Ct-試驗組管家基因Ct)-(對照組目的基因Ct-對照組管家基因Ct)]

其中，2-△△Ct表示目的基因的相對mRNA 表達量。將對照組的2-△△Ct值設為1，各試驗組數據同對照組進行比較定量分析。

1.4 數據處理與統計分析

2 結 果

2.1 沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細胞增殖率的影響

表3所示，隨著沙蔥黃酮濃度的增加各試驗組與對照組相比，淋巴細胞增殖率呈逐漸上升后趨于平穩的趨勢。當培養時間為6h時各試驗組淋巴細胞增殖率顯著高于對照組(P<0.01)，同時高、中劑量組淋巴細胞增殖率顯著高于低劑量組(P<0.01)；當培養時間由6h延長至12h時各試驗組淋巴細胞增殖率顯著上升(P<0.01)。當培養時間由12h繼續延長至24h時，低劑量組淋巴細胞增殖率顯著降低(P<0.01)，中劑量組與高劑量組淋巴細胞增殖率無顯著變化(P>0.05)。當培養時間繼續延長至48h時，各組淋巴細胞增殖率與24h時淋巴細胞增殖率無顯著改變(P>0.05)。由此可知，沙蔥黃酮具有促進綿羊外周血淋巴細胞增殖的作用，且混合培養時間為12h時此作用最為明顯，后隨著時間的延長無顯著變化；并且可以看出中劑量沙蔥黃酮即濃度為100μg·mL-1時促進淋巴細胞增殖的作用最好。

2.2 沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細胞IL-2、IL-4及IFN-γmRNA表達的影響

2.2.1 綿羊外周血淋巴細胞IL-2、IL-4、IFN-γ及β-actin熒光定量PCR擴增曲線和熔解曲線 沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細胞中各基因影響的實時熒光定量PCR反應擴增曲線和熔解曲線見圖1～3，圖中a為基因擴增曲線，b為基因熔解曲線，其中A為目的基因，B為內參基因β-actin。由圖可知，各基因擴增情況良好，擴增曲線平滑，呈現典型的S型，熔解曲線為單一峰型，并且峰型比較銳利，說明各擴增的目的基因片段長度一致，不含引物二聚體及其他雙鏈DNA污染，可用于相對定量分析。

表3 沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細胞增殖率的影響

Table 3 The effects of AMF on proliferation of lymphocytes in sheep

組別Group6h12h24h48h對照組Control0.284±0.019aA0.305±0.035bA0.302±0.035aA0.301±0.048bA低劑量組(50μg·mL-1)Lowdose0.328±0.016aB0.361±0.037cB0.354±0.034bB0.352±0.012bB中劑量組(100μg·mL-1)Moderatedose0.350±0.004aC0.386±0.021bD0.381±0.037bC0.385±0.023bD高劑量組(200μg·mL-1)Highdose0.352±0.071aC0.372±0.011bC0.377±0.078bC0.374±0.035bC

同行數據后肩注小寫字母不同表示數據差異極顯著(P<0.01)，同列數據后肩注大寫字母不同表示數據差異極顯著(P<0.01)

The different lower case letters in the same row indicate significant difference(P<0.01)，the different uppercase letters in the same column indicate significant difference(P<0.01)

圖1 沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細胞IL-2基因qPCR反應擴增曲線(a)和熔解曲線(b)Fig.1 The amplification curve and dissolution curve of AMF to sheep peripheral blood lymphocyte’s IL-2 gene

圖2 沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細胞IL-4基因qPCR反應擴增曲線(a)和熔解曲線(b)Fig.2 The amplification curve and dissolution curve of AMF to sheep peripheral blood lymphocyte’s IL-4 gene

圖3 沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細胞IFN-γ基因qPCR反應擴增曲線(a)和熔解曲線(b)Fig.3 The amplification curve and dissolution curve of AMF to sheep peripheral blood lymphocyte’s IFN-γ gene

2.2.2 沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細胞IL-2、IL-4及IFN-γmRNA表達的影響 由表4可知各劑量組沙蔥黃酮對IL-2 mRNA的表達無顯著影響；各試驗組IL-4 mRNA的表達量均極顯著低于對照組(P<0.01)，且各濃度組間比較差異均為極顯著(P<0.01)。說明沙蔥黃酮具有下調綿羊外周血淋巴細胞IL-4 mRNA表達的作用，且這種下調作用與濃度呈正相關。比較各試驗組對IFN-γmRNA表達的結果可知，各濃度沙蔥黃酮均可上調IFN-γmRNA的基因表達，與對照組比較差異極顯著(P<0.01)，高劑量組與中、低劑量組比較差異極顯著(P<0.01)，中劑量組與低劑量組比較有升高的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)。說明沙蔥黃酮對IFN-γmRNA表達有顯著的促進作用，且這種促進作用與劑量呈正相關。

表4 沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細胞IL-2、IL-4及IFN-γmRNA表達的影響

Table 4 Effects of the AMF on sheep peripheral blood lymphocyte’sIL-2，IL-4 andIFN-γmRNA expression

組別GroupIL-2IL-4IFN-γ對照組Control11a1a低劑量組(50μg·mL-1)0.994±0.0150.752±0.044b2.237±0.045b中劑量組(100μg·mL-1)1.087±0.0130.554±0.003c2.484±0.021bc高劑量組(200μg·mL-1)1.100±0.0030.144±0.005d3.394±0.174d

同列數據肩注小寫字母不同表示數據差異極顯著(P<0.01)

The different lower case letters indicate significant difference(P<0.01)

3 討 論

3.1 沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細胞增殖率的影響作用

淋巴細胞增殖能力是反應機體細胞免疫水平的重要指標之一[14]，且淋巴細胞的增殖狀態與機體細胞免疫狀態成正相關[15]。淋巴細胞增殖試驗因其所需時間較短、試驗條件穩定等優勢已經成為免疫增強藥物的初步篩選、活性強弱評定以及作用機理研究的首選方法[16]。諸多研究報道顯示，黃酮類化合物具有促進淋巴細胞增殖的活性，如楊秀松等研究報道金花葵粗黃酮具有一定的免疫調節作用，可有效促進小鼠淋巴細胞增殖、增加單核細胞吞噬指數[17]。徐璐等研究報道表明，黃芪總黃酮能顯著增強小鼠的免疫功能，可顯著提高小鼠單核巨噬細胞吞噬功能、血清溶血素水平，促進小鼠脾淋巴細胞增殖，抑制小鼠遲發型超敏反應[18]。辛歡歡等研究白花蛇舌草黃酮注射液對小鼠淋巴細胞的免疫調節活性時發現，在適當的濃度范圍內白花蛇舌草黃酮可以有效促進小鼠脾淋巴細胞增殖、細胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ的分泌[19]。除此之外大量研究表明，沙蔥及其提取物可促進機體免疫機能，沙蔥多糖可以顯著提高綿羊外周血淋巴細胞增殖、具有明顯的免疫調節活性[19]。本試驗結果顯示，隨著沙蔥黃酮濃度的增加與共同培養時間的延長，淋巴細胞增殖率呈逐漸上升后趨于平穩的趨勢，表明沙蔥黃酮具有促進綿羊外周血淋巴細胞增殖的作用，且混合培養時間為12 h時、添加劑量為100 μg·mL-1時促進淋巴細胞增殖的作用較好。這可能是因為沙蔥黃酮中含有3′，4′-環氧基-7-O-5-甲氧基黃酮醇與7-O-5，4′-二甲氧基-3′-羥基黃酮等黃酮類物質[20]，這些黃酮類化合物的基本結構與雌激素類同，參與機體免疫調節。除此之外沙蔥黃酮分子結構中C2=C3雙鍵也是沙蔥黃酮具有免疫調節活性的原因之一[20]。

3.2 沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細胞IL-2、IL-4及IFN-γmRNA表達的影響

細胞因子是指生物機體在炎癥與免疫應答過程中產生的一系列具有免疫調節活性的小分子多肽或蛋白質，而這些細胞因子均由其特定的免疫細胞表達分泌[21]。當機體受到外來因素如病毒、細菌或其他病原微生物的侵害時機體會啟動其天然免疫和特異性免疫效應機制，而細胞因子就是介導這些效應機制的分子。T細胞分泌和轉錄的細胞因子是特異性免疫應答的激活階段，而IL-2、IL-4和IFN-γ等是啟動免疫應答的關鍵因子，其中，IL-2主要來源于T細胞以及T細胞系，具有誘導T細胞產生多種淋巴因子，促進B細胞和殺傷性NK細胞的增殖與分化，促進抗體合成等生物功效[22]。IL-4主要來源于CD4+T細胞，具有促進T細胞生長、B細胞分化以及參與單核吞噬細胞的活化與抑制作用。IFN-γ也稱為免疫干擾素，具有直接促進T、B細胞分化，激活NK細胞，增強TNF對內皮細胞的作用，還具有增強細胞核體液免疫應答，激活巨噬細胞、促進巨噬細胞的吞噬能力除去病原微生物與癌變細胞等作用。黃酮類化合物作為植物天然有效成分具有較強的免疫調節作用，且其免疫調節活性已經成為黃酮類化合物研究的熱點問題。唐浩國等研究報道，竹葉黃酮在0～80 μg·mL-1可顯著提高小鼠脾細胞的細胞增殖率并且促進脾細胞IFN-γ基因mRNA表達，促進T和B淋巴細胞的增殖與分化，顯著增強小鼠免疫調節作用[23]。徐波等研究報道稱地錦草總黃酮可有效提高機體免疫機能，并有效促進免疫相關細胞因子IL-2、IFN-γ等基因的mRNA表達[24]。朱兆榮等研究報道，復方苦芩可有效增強小鼠非特異性免疫功能，同時能夠降低犬血清細胞因子IL-4含量及其mRNA表達，升高犬血清IFN-γ含量及其mRNA表達[25]。楊曉航等研究報道，黃芪總黃酮具有調節佐劑性關節炎模型大鼠外周血細胞因子表達水平的作用[26]。基于本試驗研究結果認為，沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細胞具有一定的免疫調節活性。這種生物活性可能與其獨特的生物分子結構有關，其所含的3′，4′-環氧基-7-O-5-甲氧基黃酮醇與7-O-5，4′-二甲氧基-3′-羥基黃酮等黃酮類化合物分子結構中C2=C3結構和類雌激素結構等均是免疫增強結構基團，這些基團作用于淋巴細胞后，通過上調綿羊外周血淋巴細胞中IFN-γmRNA的表達，下調IL-4 mRNA的表達起到有一定的體外免疫調節作用，但其具體分子信號通路以及作用機制還有待于進一步研究證實。

4 結 論

基于上述研究結果，推測沙蔥黃酮發揮免疫調節作用的部分機制：通過促進綿羊外周血淋巴細胞增殖，上調IFN-γmRNA表達，下調IL-4 mRNA表達，進而實現其對綿羊的免疫調節活性。

[1] 敖長金.沙蔥化學成分及其生物學功能研究進展[J].飼料工業，2010，(18)：5-9. AO C J.Recent advances in chemical iingredients and biological function ofAlliumMongolicumRegel[J].FeedIndustry，2010，(18)：5-9.(in Chinese)

[2] 薩茹麗，楊 斌，敖長金.沙蔥有效提取物對肉仔雞免疫機能影響的研究[J].飼料工業，2009，30(10)：28-41. SA R L ，YANG B，AO C J.Effect ofAlliummongolicumRegelextracts on the immune fuction for broilers[J].FeedIndustry，2009，30(10)：28-41.(in Chinese)[3] 宋巴達瑪.沙蔥多糖對肉羊免疫機能和抗氧化作用的影響[D].呼和浩特：內蒙古農業大學，2010：5-7. SONG B D M.Study on the effect of polysaccharide fromAlliumMongolicumRegelon immune function and antioxidation in meat sheep[D].Hohhot：Inner Mongolia Agricultural University，2010：5-7.(in Chinese)

[4] 烏仁張嘎.沙蔥揮發油的提取，成分鑒定及其體外抑菌效果的研究[D].呼和浩特：內蒙古農業大學，2011：18-20. WU R Z G.Studies on extracting process，chemical constituents and antibacterial effects of essential oils fromAlliumMongolicumRegel[D].Hohhot：Inner Mongolia Agricultural University，2011：18-20.(in Chinese)

[5] 扈瑞平.沙蔥多糖的分離、純化和結構鑒定及其生物學活性的研究[D].呼和浩特：內蒙古農業大學，2010：4-5. HU R P.Studies on separation，purification，structural identification and biological activity ofAlliumMongoliumRegelpolysaccharides[D].Hohhot：Inner Mongolia Agricultural University，2010：4-5.(in Chinese)

[6] 趙春艷.沙蔥中總黃酮的分離純化、結構鑒定及其對機體免疫抗氧化機能影響的研究[D].呼和浩特：內蒙古農業大學，2008：10-28. ZHAO C Y.Studies on separation，purification and structural characterizations of flavonoids from Allium mongolia Regel and its effects on immunity and antioxidant function in body[D].Hohhot：Inner Mongolia Agricultural University，2008：10-28.(in Chinese)

[7] 王麗思，敖長金，張興夫.沙蔥多糖對小鼠腹腔巨噬細胞的激活作用[J].中國畜牧獸醫，2010，37(4)：50-52. WANG L S，AO C J，ZHANG X F.Activation of peritoneal macrophages by polysaccharides extracted fromAlliumMongolicumRegelin mice[J].ChinaAnimalHusbandry&VeterinaryMedicine，2010，37(4)：50-52.(in Chinese)

[8] 趙春艷，敖長金，繆亞娟，等.沙蔥中黃酮類化合物分離提取工藝的研究[J].黑龍江畜牧獸醫，2010，(1)：131-133. ZHAO C Y，AO C J，MIAO Y J.Extraction of flavonoids fromAlliumMongolicumRegel[J].HeilongjiangAnimalScienceandVeterinaryMedicine，2010，(1)：131-133.(in Chinese)

[9] 趙春艷，敖長金，繆亞娟，等.沙蔥黃酮對小鼠抗氧化能力的影響[J].飼料工業，2009，30(24)：10-13. ZHAO C Y，AO C J，MIAO Y J.Effect of flavone inAlliumon antioxidant capacity for mouse[J].FeedIndustry，2009，30(24)：10-13.

[10] 趙春艷，敖長金，張興夫.沙蔥中黃酮類化合物對小鼠非特異性免疫機能影響的研究[J].飼料工業，2010，31(18)：11-14. ZHAO C Y，AO C J，ZHANG X F.Studies on flavonoids fromAlliumMongolicumRegeleffects to non-specific immunity function in mice[J].FeedIndustry，2010，31(18)：11-14.(in Chinese)

[11] 包美艷，敖長金，趙飛艷，等.沙蔥多糖對綿羊外周血淋巴細胞的調節作用研究[J].飼料工業，2013，34(12)：9-12. BAO M Y，AO C J，ZHAO F Y，et al.Study on the reguleting effect ofAlliumMongolicumRegelpolysaccharides on peripheral blood lymphocytes of sheep[J].FeedIndustry，2013，34(12)：9-12.(in Chinese)

[12] 趙飛艷，敖長金，包美艷，等.沙蔥多糖對綿羊外周血淋巴細胞IFN-γ與STAT1 mRNA表達的影響[J].畜牧獸醫學報，2013，44(12)：1932-1938. ZHAO F Y，AO C J，BAO M Y，et al.Effect ofAlliumMongolicumRegelpolysaccharides on IFN-γ and STAT1 mRNA expression in peripheral blood[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2013，44(12)：1932-1938.(in Chinese)

[13] STEPHENSON F H.Calculations for molecular biology and biotechnology：A guide to mathematics in the laboratory 2e[M].Academic Press，2010.

[14] KIM H M，HANS B，OH G T，et al.Stimulation of humoral and cell mediated immunity by polysaccha-ride from mushroom Phellinus Linteus[J].IntJImmunopharmacol，1996，18(5)：295-303.

[15] 高 煥，王德云，郭利偉，等.淫羊藿多糖脂質體對雞淋巴細胞增殖及 IL-2、IL-4 和 IFN-γ mRNA 表達的影響[J].畜牧獸醫學報，2013，44(1)：115-121. GAO H，WANG D Y，GUO L W，et al.Effect of epimedium polysaccharide liposome on lymphocyte proliferation，mRNA expression of IL-2，IL-4 and IFN-γ in chicken[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2013，44(1)：115-121.(in Chinese)

[16] 賀新懷.中醫藥免疫學巨[M].北京：人民軍醫出版社，2002：408. HE X H.Chinese medical immunology[M].Beijing：People's Military Medical Press，2002：408.

[17] 楊秀松.金花葵粗黃酮提取物的免疫調節作用研究[J].中國藥師，2013，(9)：1307-1311. YANG X S.Immunoregulation of crude flavonoids fromAbelmoschusManihotFlower[J].ChinaPharmacist，2013，(9)：1307-1311.(in Chinese)

[18] 徐 璐，李艷明，劉婧陶，等.黃芪總黃酮對小鼠免疫功能的影響[J].動物醫學進展，2013，34(11)：36-39. XU L，LI Y M，LIU J T.Effects of total flavones of astragalus on immune function in mice[J].ProgressinVeterinaryMedicine，2013，34(11)：36-39.(in Chinese)

[19] 辛歡歡，李春玲，王貴平.白花蛇舌草黃酮注射液對小鼠脾淋巴細胞的免疫增強作用[J].中國獸醫科學，2010，40(7)：752-757. XIN H H，LI C L，WANG G P.Immunological enhancement of flavones of oldenlandia diffusa wild injection on mouse splenic lymphocytes[J].ChineseVeterinaryScience， 2010，40(7)：752-757.(in Chinese)

[20] 薩茹麗.沙蔥黃酮提取工藝優化、結構鑒定及其相關生物活性研究[D].呼和浩特：內蒙古農業大學，2014：100-101. SA R L.Studies on extraction process，structural identification and related biological activity ofAlliumMongolicumRegelflavonoids[D].Hohhot：Inner Mongolia Agricultural University，2014：100-101.(in Chinese)

[21] FIORENIIONO D F，BOND M V，MOSMANN T R.Two type of mouse T helper cell .1V.Th2clones secrete a factor that inhibitors cytokine produetion by Thl elones[J].JExpMed，1989，170(6)：2081-2095.

[22] PEDERSEN S F，KRAMBOFT B，JORGENSEN N K，et al.Shrinkage-induced aetivation of the Na+/H+exehange in Ehrllch aseites tumor cells：mechanisms involved in the activation and a role for the exchanger in cells volume regulation[J].JMemborBiol，1996，149(5)：141-159.

[23] 唐浩國，魏曉霞，李 葉，等.竹葉黃酮對小鼠脾細胞免疫的分子機制研究[J].食品科學，2007，28(9)：523-526. TANG H G，WEI X X，LI Y，et al.Study on molecule mechanism of immunoregulation to spleen cells of rat with flavonoids from bamboo leaves[J].FoodScience，2007，28(9)：523-526.(in Chinese)

[24] 徐 波，張建超，付作明，等.地錦草總黃酮對小鼠免疫功能及細胞因子 mRNA 表達影響[J].中獸醫醫藥雜志，2010 (5)：22-26. XU B，ZHANG J C，FU Z M，et al.Effects of euphorbiae humifusae total flavonoids on immunity and mRNA expression of some cytokines in mice[J].JournalofTraditionalChineseVeterinaryMedicine，2010，(5)：22-26.(in Chinese)

[25] 朱兆榮，劉 娟，杜林林，等.復方苦芩對小鼠免疫功能及犬 IL-4 mRNA 和 IFN-γ mRNA 表達的影響[J].中國獸醫科學，2012，42(8)：875-880. ZHU Z R，LIU J，DU L L，et al.Effect of Kuqin compound on immune function of experimental animals and on expressions of canine IL-4 mRNA and IFN-γ mRNA [J].ChineseVeterinaryScience，2012，42(8)：875-880.(in Chinese)

[26] 楊曉航，史傳道，葉崢嶸，等.黃芪總黃酮對佐劑性關節炎模型大鼠 IL-4、IFN-γmRNA 表達影響的研究[J].陜西醫學雜志，2010，(8)：944-946. YANG X H，SHI C D，YE Z R，et al.Effect of TFA on expression of IL-4 mRNA and IFN-γ mRNA in adjuvant arthritis in rats model[J].ShaanxiMedicalJournal，2010，(8)：944-946.(in Chinese)

(編輯 郭云雁)

Effect ofAlliumMongolicumRegelFlavonoidson Lymphocyte Proliferation，mRNA Expression ofIL-2，IL-4，IFN-γin Peripheral Blood Lymphocyte of Sheep

SA Ru-li1，MU Qi-er1，WANG Cui-fang1，BAO Ling-ling1，AO Chang-jin1*，WANG Si-zhen2

(1.CollegeofAnimalScience，InnerMongoliaAgriculturalUniversity，Hohhot010018，China；2.CollegeofAnimalScienceandTechnology，InnerMongoliaUniversityfortheNationalities，Tongliao028000，China)

In order to study the action mechanism ofAlliumMongolicumRegelFlavonoids(AMF) on immunological enhancement activity，the effects of AMF on lymphocyte proliferation and mRNA expression ofIL-2，IL-4 andIFN-γwere determined by MTT method and real-time fluorescent quantitation PCR assay.The peripheral blood lymphocyte of sheep was used in this study.The results showed that AMF could significantly enhance lymphocyte proliferation.AMF could significantly up-regulate mRNA expression ofIFN-γ，down-regulate mRNA expression ofIL-4，and have no significantly effect onIL-2 mRNA expression.The result indicate that AMF has immunoregulatory activity and could enhance lymphocyte proliferation.

AlliumMongolicumRegelFlavonoids；lymphocyte proliferation；IL-2；IL-4；IFN-γ

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.024

2014-09-05

國家自然科學基金地區科學基金項目(31260558；31160474)；“十二五”國家科技支撐計劃(2013BAD10B04)

薩茹麗(1986-)，女，內蒙古自治區興安盟人，博士生，主要從事動物營養與畜產品品質研究，E-mail：qisaruli@126.com

*通信作者：敖長金，教授，博士生導師，主要從事動物營養與飼料科學研究，E-mail：changjinao@aliyun.com

S826；S813.3

A

0366-6964(2015)06-1063-08