烏骨雞黑色素細胞體外原代培養及鑒定

韓德平，王書祥，張媛媛，楊 祖，李俊英，鄧學梅

(中國農業大學動物科技學院，畜禽遺傳改良北京市重點實驗室，北京 100193)

烏骨雞黑色素細胞體外原代培養及鑒定

韓德平，王書祥，張媛媛，楊 祖，李俊英，鄧學梅*

(中國農業大學動物科技學院，畜禽遺傳改良北京市重點實驗室，北京 100193)

旨在建立烏骨雞黑色素細胞體外培養和鑒定的方法，為研究黑色素細胞功能提供理想的生物材料。本研究選取烏骨雞腹膜組織，采用DispaseⅡ和胰酶-EDTA混合消化法，經嚴格控制不同培養階段的消化時間，對黑色素細胞進行純化和傳代，獲取了烏骨雞黑色素細胞。通過觀察各個培養階段的細胞形態和細胞生長曲線，表明在專用培養基條件下，細胞增殖良好。根據細胞形態特征、電鏡下的亞細胞結構、黑色素合成相關基因的表達分析、DOPA染色和細胞免疫化學染色鑒定，表明所獲得的細胞符合黑色素細胞特征。細胞經傳代后培養至第10代，仍保持了正常的生物學特性，說明所建立的培養體系可以實現烏骨雞黑色素細胞體外原代培養。綜上表明，本研究成功建立了烏骨雞黑色素細胞體外分離培養體系。

烏骨雞；黑色素細胞；原代培養；鑒定

絲羽烏骨雞是我國珍貴的家禽品種，具有絲羽、烏骨、烏肉等特征[1]，因其傳統的藥用價值而備受關注[2]。人們普遍認為，烏骨雞的藥用價值主要源于其體內存在的大量黑色素[3]。研究發現，黑色素細胞廣泛分布于烏骨雞體內各組織器官，黑色素細胞分布和黑色素的合成在不同日齡的組織內存在差異，在氣管、肺、睪丸、卵巢以及嗉囊等組織，黑度隨日齡增長而逐漸加深；而腿肌和胸肌等組織的黑度卻隨著日齡增長而逐漸變淺[4]。骨膜和腹膜等結締組織，無論在胚胎期還是生長發育期，都表現為大量的黑色素沉積。因此，選取骨膜和腹膜用于黑色素細胞的分離培養，是較好的選擇。

黑色素細胞是黑色素的產生來源，完全分化的成熟黑色素細胞是一種帶有許多長突起的伸長細胞[5]。烏骨雞黑色素可以延長果蠅壽命，并有增強果蠅排鉛解毒的能力[6]。人皮膚內黑色素合成過程中的副產物對細菌具有氧化殺傷作用[7-8]。在炎癥條件下，皮膚角質細胞和白細胞釋放的炎癥介質會促進黑色素細胞合成黑色素和形成更多細胞突起[9-10]。除作為黑色素的合成場所以外，黑色素細胞還具有許多重要的功能。有研究表明，黑色素細胞在維持組織結構和損傷后免疫應答過程中發揮重要作用。最近的研究發現，組織損傷的局部環境會直接誘導黑色素細胞遷移至損傷部位[11]。在斑馬魚損傷試驗中發現，早期遷移的免疫細胞通過釋放信號分子，誘導黑色素細胞遷移至損傷部位，進一步通過細胞突起包裹外來物質[12]。另有資料報道，位于人內耳紋狀體內的巨噬細胞樣黑色素細胞，會通過調控緊密連接相關蛋白的表達來影響血管屏障的完整性，從而造成聽覺障礙[13]。黑色素細胞的功能是多樣的，其作用機制值得深入探討。

烏骨雞作為黑色素細胞及黑色素極為豐富的自然突變體，已成為相關功能研究的重要模型。目前，針對烏骨雞黑色素細胞的分離培養方法雖有報道，但其培養效率還不夠理想。本研究旨在建立烏骨雞原代黑色素細胞體外分離培養體系，為研究烏骨雞黑色素細胞生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

20胚齡烏骨雞胚胎來自中國農業大學實驗牧場。黑色素細胞培養基主要成分為人黑色素細胞生長添加物(HMGS，Gbico)，其中含有牛垂體提取物、胎牛血清、牛胰島素、牛轉鐵蛋白、基本成纖維細胞生長因子、氫化可的松、肝素、佛波醇酯。

1.2 方法

1.2.1 黑色素細胞的原代分離培養 取孵化20 d的烏骨雞蛋，酒精擦拭蛋殼表面，經紫外線照射消毒30 min。沿氣室一側敲破蛋殼，取出雞胚，無菌剪取腹膜。經滅菌生理鹽水清洗后，置于Medium 254(Gibco)中，用眼科剪剪碎組織。置于15 mL離心管中，加入適量蛋白酶(Dispase) Ⅱ酶(Roche)和胰酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液(Gibco)，37 ℃消化15 min，加入胎牛血清，終止消化，反復吹打后經200目細胞篩過濾。1 000 r·min-1離心10 min，加入新鮮培養基吹打混勻。1 000 r·min-1離心10 min，加入含HMGS的新鮮培養基混勻，計數細胞，以2×105mL-1接種于細胞瓶中。置于5% CO2、37 ℃培養箱中培養，12 h后吸棄培養液，去除未貼壁的細胞和上清，以后每2 d換液1次。

1.2.2 黑色素細胞純化與傳代培養 觀察培養瓶中細胞生長狀況，至細胞達70%融合時，用0.25%胰酶-0.02% EDTA消化液(Gibco)37 ℃消化7～10 min，鏡下觀察細胞消化狀態。棄去消化液，加入滅菌PBS清洗后棄掉。再加入新鮮消化液消化5 min，棄掉消化液，此時只有含黑色素的細胞仍然貼壁細胞瓶，加入含人黑色素細胞生長添加物(HMGS，Gbico)的新鮮培養基Medium 254，繼續置于5% CO2、37 ℃培養箱中培養，每2 d換液1次。消化培養3次即可得到純的黑色素細胞。傳代培養時消化時間為10 min，1個25 mL細胞瓶傳代2個25 mL細胞瓶。

1.2.3 黑色素細胞生長率的測定 取處于對數生長期的黑色素細胞，0.25%胰酶-0.02% EDTA消化液消化，調整細胞濃度為4×104mL-1，按200 μL每孔接種于96孔板，于37 ℃、5% CO2培養箱培養。從接種24 h開始，每日隨機取3個孔做細胞計數(CCK-8)比色試驗，計算平均值，共計數14 d，未計數細胞每2 d換液1次。加入100 μL 10% CCK-8，繼續培養4 h，自動酶標儀450 nm波長測吸光度值，繪制細胞生長曲線。

1.2.4 RT-PCR及序列測定 取培養至第5代的細胞，接種于6孔板中，加入生長培養基培養。待細胞長至80%融合后，利用細胞RNA提取試劑盒(TIANGEN)提取細胞總RNA，并反轉錄cDNA，根據美國國立生物技術信息中心(NCBI)GenBank公布的相關序列設計引物(Primer Premier 5.0軟件)，引物由北京生工生物技術有限責任公司合成，引物序列見表1。鑒定引物擴增特異性時，設置陰性對照，此時不加cDNA模板，其它條件一致。PCR產物由華大基因公司測序鑒定。

1.2.5 抗Microphthalmia(MITF)免疫細胞化學染色 取第5代處于對數生長期的黑色素細胞，調整細胞濃度為2×105mL-1，接種于6孔板，37 ℃、5% CO2培養箱培養2 d。PBS清洗2次，4%多聚甲醛液室溫固定20 min。0.1% Triton X-100室溫處理10 min，PBS洗2次。山羊血清封閉液室溫作用20 min，吸棄封閉液，加入抗MITF(1∶2 000，Abcam)抗體,37 ℃作用1 h，PBS清洗3次。加入HRP標記抗小鼠二抗(1∶1 000，北京中杉金橋生物技術有限公司)，室溫作用1 h，PBS清洗3次。二氨基聯苯胺(DAB)室溫避光顯色5 min。水溶性封片劑封片后，置于倒置顯微鏡下觀察。陰性對照染色時用PBS替代一抗，經二抗作用后，DAB顯色觀察。

表1 引物序列

Table 1 Information of primer sequence for the genes

基因Gene引物序列(5'-3')Primersequence擴增片段長度/bpProductsizeMITFF:TGTCCCTTGTTCCATCC,R:ACATTTCCGAGGTTGTCAC204TYRF:TCAAGGACCCCAAGACTCCC,R:CGGAAGCTGTAATTGGCCATT106TRP-1F:GCTAAGAAGGTATTCGGCT,R:AGTGAGAAGAGGCTGATGC376KITF:CATCGGTGCCATCCTTTGAG,R:CTTGTCACCATTGCTGGATGC110

1.2.6 多巴染色鑒定 取第5代處于對數生長期的黑色素細胞，調整細胞濃度為2×105mL-1，接種于6孔板，37 ℃、5% CO2培養箱培養2 d。PBS清洗2次，4%多聚甲醛液室溫固定20 min。PBS清洗后，加入3，4-二羥基-L-苯丙氨酸孵育液(DOPA，Sigma-Aldrich；1L PBS中含1.104 g DOPA)，37 ℃孵育30 min。更換新的DOPA孵育液，直至孵育液顏色變色后終止反應。甘油封片后，置于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7 透射電鏡觀察 取長滿至80%的第5代細胞，用0.25%胰酶-0.02% EDTA消化，制成單細胞懸液，1 000 r·min-1離心10 min。加入PBS，混勻重懸細胞，1 000 r·min-1離心10 min，重復1次。最后離心成細胞團塊，加入2.5%戊二醛固定后，送至中國農業大學電鏡室進行超微結構觀察。

2 結 果

2.1 烏骨雞體內黑色素細胞的培養與形態觀察

由于采用腹膜分離黑色素細胞，所以培養上清中含有較多脂肪，12 h后棄掉上清和未貼壁的細胞。12 h時黑色素細胞已出現明顯突起，24 h時細胞基本完全貼壁(圖1A)，細胞傳代過程中采用控制不同的消化時間去除雜細胞的方法，瓶內只留貼壁黑色素細胞(圖1B)；繼續培養至9 d，黑色素細胞形成明顯多個突起，胞質內未見明顯黑色素(圖1C)；培養至10 d，細胞數量和突起進一步增多(圖1D)，部分黑色素細胞胞質內可見明顯的黑色素沉積(圖1E)，并形成交聯(圖1F)。

2.2 黑色素細胞生長曲線測定

經檢測，體外培養的黑色素細胞前期生長緩慢，從第7天開始細胞生長迅速，出現指數增長，至10 d細胞增長緩慢，出現停滯期(圖2)，此時，合成的黑色素明顯增多。

2.3 黑色素合成相關基因檢測

黑色素細胞經純化培養后，傳至第10代，進行MITF、TYR、TRP-1和KIT基因表達檢測。RT-PCR結果顯示4種基因均有特異性擴增條帶(圖3)，細胞正常生長。擴增產物測序結果通過比對，為目的基因的核苷酸序列，表明擴增基因確實在細胞中有表達。

2.4 免疫細胞化學染色

取第5代處于對數生長期的黑色素細胞進行觀察，此時，并不是所有黑色素細胞均可見明顯黑色素沉積。因此，通過MITF免疫細胞染色鑒定黑色素細胞。圖4A中可見，MITF染色后陽性信號位于黑色素細胞的胞核部分。而圖4B可見，陰性對照染色時(不加一抗)，肉眼觀察僅有不足半數的黑色素細胞胞漿內呈現明顯的黑色素顆粒。由此說明，黑色素細胞經體外培養，已大量增殖。但由于不同生長階段的黑色素細胞內黑色素合成狀態亦有不同，不能單純依據黑色素顆粒來判定細胞特性。

2.5 多巴染色

由于黑色素細胞含有大量酪氨酸酶，能夠氧化多巴形成黑色物質，因此通過多巴染色可以鑒定黑色素細胞特性。本試驗結果發現，經傳代的培養細胞用多巴染色后，均呈現陽性反應。黑色素細胞突起明顯，可以明顯觀察到胞漿內含有大量均質染色的黑色物質(圖5)。

A.培養24 h；B.消化傳代后；C.傳代培養9 d；D.傳代培養10 d；E.明顯黑色素沉積；F.黑色素細胞形成交聯。箭頭指示黑色素細胞。標尺：50 μmA.Culture after 24 h；B.Digestion and passage；C.Passage on day 9；D.Passage on day 10；E.Obvious accumulation of melanin；F.Close contact of melanocytes.The arrows indicate the melanocytes.Bar：50 μm圖1 體外培養烏骨雞黑色素細胞形態Fig.1 The morphology of cultured melanocytes from Silky Fowl

圖2 烏骨雞黑色素細胞生長曲線Fig.2 The growth curve of cultured melanocytes from Silky Fowl

2.6 透射電鏡觀察

收集黑色素細胞進行透射電鏡觀察，見圖6。結果顯示，黑色素細胞的胞漿內可見各種不同階段的黑色素小體形成過程。說明，分離培養的細胞產生的黑色物質是黑色素，成功實現黑色素細胞分離培養。

1.TRP-1基因；2.TRP-1陰性對照；3.KIT基因；4. KIT基因陰性對照；5.MITF基因；6.MITF基因陰性對照；7.TYR基因；8.TYR基因陰性對照；M.DM2000 plus marker1.TRP-1 gene；2.TRP-1 negative；3.KIT gene；4.KIT negative；5.MITF gene；6.MITF Negative；7.TYR gene；8.TYR negative；M.DM2000 plus marker圖3 MITF、TYR、TRP-1和KIT基因RT-PCR檢測Fig.3 Detection of MITF，TYR，TRP-1 and KIT genes by RT-PCR

3 討 論

3.1 烏骨雞黑色素細胞體外分離培養條件優化

人類及其它動物黑色素細胞分離培養由來已久，但是皮膚組織是目前分離培養的主要選擇。研究發現，通過0.25% 胰酶消化人包皮組織，可以成功分離到黑色素細胞，但需要14 d細胞才能全部長滿[14-15]。對于新生豬皮膚，通過0.25% 胰酶消化，3周后黑色素細胞長滿融合[16]。白瑞等[17]通過分離培養羊駝皮膚黑色素細胞，發現利用0.2% Dispase和0.25%胰酶-0.02% EDTA兩步消化法是分離有毛皮膚黑色素細胞的最佳方法，既可以減少對細胞的損傷，又可以提高細胞的分離純度，縮短試驗操作時間。烏骨雞黑色素細胞的分離培養少見報道，僅見于皮膚組織分離培養[18]。由于烏骨雞黑色素細胞位于皮膚的真皮層，細胞成分相對復雜，加大了分離培養的難度[19]。而烏骨雞黑色素細胞多位于結締組織，腹膜內黑色素細胞較為豐富[20]。并且相對于皮膚而言，腹膜內細胞成分較為簡單。本研究選取雞胚胎期腹膜組織分離黑色素細胞，原因主要是烏骨雞雞胚在蛋殼內，未接觸外界環境，細菌污染少。結果表明，烏骨雞胚胎期的腹膜組織特別適合于原代黑色素細胞的分離培養，培養條件經優化后培養9 d即可獲得大量黑色素細胞，并保持其生物學特性。

A.MITF免疫細胞化學染色；箭頭指示陽性細胞；B.陰性對照。空心箭頭.胞漿內可見明顯黑色素，實心箭頭.胞漿內未見黑色素。標尺：50 μmA.Immunocytochemical stain of MITF.The arrows indicate positive cells；B.Negative control.Feint arrow indicates obvious melanin is observed in the cytoplasm，solid arrow indicates no melanin is observed in the cytoplasm.Bar：50 μm圖4 黑色素細胞MITF免疫細胞化學染色Fig.4 Immunocytochemical stain of MITF in melanocytes

箭頭指示黑色素細胞內多巴反應陽性信號。標尺：50 μmThe arrows indicate the DOPA positive signals in melanocytes.Bar：50 μm圖5 多巴染色顯示黑色素細胞Fig.5 Observation of melanocytes using DOPA stain

箭頭指示黑色素細胞內不同階段的黑色素小體The arrows indicate the different stages of melanosomes in melanocytes圖6 黑色素細胞透射電鏡觀察Fig.6 Observation of melanocytes by transmission electron microscope

先期分離試驗發現，單純的0.25% 胰酶-0.02% EDTA消化需要較長時間，增加了細胞損傷程度，而且分離到的黑色素細胞數量較少。后選用0.2% Dispase和0.25% 胰酶-0.02% EDTA聯合消化法，同時將兩種消化酶加入到剪碎組織中，縮短了消化時間，減少長時間消化對細胞的損傷，分離到的黑色素細胞數量多，培養效果好。

純化細胞時，多根據黑色素細胞和其它細胞的貼壁時間和消化時間的不同，通過控制時間差來純化細胞。本試驗發現，黑色素細胞和成纖維細胞的貼壁時間相似，所以很難通過控制貼壁時間來消除成纖維細胞。但是由于黑色素細胞貼壁牢固，可以通過控制消化時間來分離黑色素細胞與雜細胞。雜細胞首先會被消化下來，通過棄上清后可以清除成纖維細胞等雜細胞。本研究在消化雜細胞后，直接將完全培養基加入到培養瓶中，不再進一步消化黑色素細胞，可以減少胰酶對細胞的消化損傷，黑色素細胞可以快速長滿融合。

3.2 黑色素細胞培養基的選擇

原代黑色素細胞培養所需培養基極其嚴格。劉源等[21]培養人黑色素細胞時，研究發現加入佛波酯(TPA)和胎牛血清的角質細胞培養基(K-SFM)內，黑色素細胞生長旺盛，優于加入TPA、霍亂毒素(CT)、磷酸二酯酶抑制劑(IBMX)和谷氨酰胺的DMEM和F12混合培養基。TPA可以活化蛋白激酶C，通過ADG/PKC信號途徑刺激黑色素細胞增殖。而TPA作為一種致癌劑，存在很大安全風險，同時也會限制某些色素性疾病的研究。霍亂毒素是神經毒素，可活化腺苷酸環化酶，通過cAMP/PKA途徑刺激黑色素細胞增殖。白瑞等[17]通過采用DMEM/F12基礎培養基，加入堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、CT、氫化可的松、胰島素和慶大霉素后，羊駝皮膚黑色素細胞生長良好。bFGF是天然有絲分裂原，可活化酪氨酸激酶，經受體介導活化MAKP通路，促進細胞有絲分裂。胰島素通過受體酪氨酸激酶途徑，可以促進氨基酸進入細胞，促進蛋白質的合成代謝。本研究先前采用DMAM和F12混合培養基，加入HEPES、bFGF、氫化可的松、胰島素、TPA和胎牛血清，可以維持黑色素細胞生長，但是生長周期較慢。后選用原代黑色素細胞專用培養基，營養成分與之前相比，多加入牛垂體提取物、牛轉鐵蛋白和肝素，此時細胞增殖周期有所縮短，生長狀態較好。所以正確選擇培養基也是黑色素細胞培養成功的關鍵。

3.3 黑色素合成相關基因正常表達

烏骨雞體內的黑色素主要為真黑色素，其合成是一個復雜的生化反應過程。體內的酪氨酸在酪氨酸酶(TYR)的作用下氧化成多巴，TYR進一步將多巴氧化為多巴醌，多巴醌環化生成多巴色素，后經多巴色素異構酶(TRP)的作用生成5，6-二羥基吲哚羧酸，最后在氧化酶的作用下生成真黑色素[22]。所以TYR和TRP是黑色素合成過程中的關鍵酶，其基因表達水平可以反映黑色素細胞的生理狀態。

烏骨雞體內的黑色素細胞來自于神經嵴細胞，神經嵴細胞經腹側和背側遷移過程發育為成黑色素細胞。成黑色素細胞進一步在皮膚和內臟組織形成黑色素細胞，并產生黑色素。KIT基因被認為表達于成黑色素細胞，作為一種受體，通過與周圍環境表達的干細胞因子(SCF)配體作用，調控細胞的存活[23]。而MITF基因是促進成黑色素細胞特化的首要轉錄因子，目前被認為是最主要的調控基因[24]。研究表明，在烏骨雞胚胎發育早期，這幾種基因表達上調，對于黑色素細胞遷移和存活具有重要意義[25]。

本研究培養的黑色素細胞內，既檢測到黑色素合成基因的表達，也檢測到與成黑色素細胞分化相關基因的表達，說明培養的黑色素細胞完全具有增殖和合成黑色素的活性，適合進行體外黑色素細胞的相關功能研究。

3.4 烏骨雞黑色素細胞生物學特性分析

本試驗在黑色素細胞培養過程中，通過控制消化時間，成功分離到胞漿內含有黑色素的細胞。繼而通過傳代培養，進一步純化黑色素細胞。觀察發現，體外培養的黑色素細胞與組織內觀察到的細胞形態基本一致，都是具有長突起的樹突樣細胞。

體內試驗認為，MITF基因作為關鍵基因，與多個基因存在直接關聯，其中Sox10和Pax3可調控MITF的表達，而TRP1、TRP2、TYR、EDNRB、EDN3基因也受MITF調控，所以其表達水平可以反應細胞的活性狀態[26]。由于MITF可通過調控酪氨酸基因家族啟動子，進而影響酪氨酸基因的表達，影響黑色素的合成，所以在體外細胞培養時檢測其表達水平，可以在一定程度上鑒定細胞特性。本研究通過免疫細胞化學染色，發現培養的黑色素細胞胞核內MITF蛋白的高表達。與此時黑色素細胞增殖旺盛，黑色素合成較多有關。本研究結果與之前報道豬皮膚黑素細胞和羊駝皮膚黑色素細胞的MITF表達位置相一致[16-17]。所以，通過檢測MITF蛋白的表達，可以在一定程度上鑒定黑色素細胞，并且指示黑色素細胞的活性狀態。

電鏡結果進一步證實，分離培養的細胞是黑色素細胞，胞漿內可觀察到不同階段黑色素小體的形成過程。而且，利用黑色素細胞含有的酪氨酸酶能夠氧化多巴形成黑色反應物質的特性，進行了多巴染色，發現胞漿內呈現明顯黑色物質，培養的黑色素細胞具有明顯的突起，符合烏骨雞黑色素細胞的特征。由于黑色素顆粒不需多巴染色即可呈現，未經多巴染色時，可觀察到部分細胞胞漿內有明顯的黑色素沉積，而大部分細胞的胞漿內未見明顯黑色素顆粒。經多巴染色后，所有細胞均呈現陽性反應。說明體外培養的黑色素細胞處于不同的黑色素合成狀態，或無外界刺激時，并不一定合成黑色素，進一步成熟或出現外界刺激時，可增加黑色素的合成。

4 結 論

本研究通過選取胚胎腹膜和專用培養基，利用消化時間差異成功建立了烏骨雞黑色素細胞體外分離培養體系。并經細胞形態和黑色素小體觀察，多巴反應、MITF蛋白和黑色素合成相關基因的表達等檢測，進一步確定了細胞的生物學特性，為今后研究黑色素細胞功能奠定基礎。

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(編輯 程金華)

Culture and Identification of Primary Melanocytes from Silky Fowlinvitro

HAN De-ping，WANG Shu-xiang，ZHANG Yuan-yuan，YANG Zu，LI Jun-ying，DENG Xue-mei*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China)

The purpose of this study was to establish a method for melanocytes culture and identification systeminvitro，and to provide an ideal biological material for investigating the melanocytes functions.Peritoneum of Silky Fowl was collected and digested by dispaseⅡ and trypsin-EDTA mixed digestive solution under different digestive time.The pure melanocytes were obtained after continuous passages.Through the observation of cell morphology and cell growth curve showed that the primary melanocytes grew well under the specific medium.The cell specificities were further confirmed by the morphology，ultrastructure observation under electron transmission microscope，genes expression associated with melanin synthesis，and cell characteristic by DOPA stain and immunocytochemistry.The successfully cultured melanocytes sustained the normal biological characteristics on passage 10 demonstrating that the culture of primary melanocytes was accomplished under thisinvitrosystem.All together，theinvitroculture system of melanocytes from Silky Fowl was successfully established in our study.

Silky Fowl；melanocyte；primary culture；identification

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.010

2014-10-30

國家自然科學基金(31472082)；國家863計劃(2013AA102501)；中央高校基本科研業務費專項資金(2014BH003)

韓德平(1984-)，男，山東濰坊人，博士，主要從事組織胚胎學的研究，E-mail：handeping1984@163.com

*通信作者：鄧學梅，E-mail：deng@cau.edu.cn

S813.3

A

0366-6964(2015)06-0949-08