富硒女貞子對熱應激乳腺上皮細胞增殖、凋亡及抗氧化功能的影響

鄒 慧，李丹丹，陳 靜，勞雪芬，曹 錚，尚秋辰，許小琴*

(1.揚州大學獸醫學院，揚州 225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，揚州 225009)

富硒女貞子對熱應激乳腺上皮細胞增殖、凋亡及抗氧化功能的影響

鄒 慧1，2，李丹丹1，2，陳 靜1，2，勞雪芬1，2，曹 錚1，2，尚秋辰1，2，許小琴1，2*

(1.揚州大學獸醫學院，揚州 225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，揚州 225009)

為闡明富硒女貞子及其主要成分對高溫體外培養乳腺上皮細胞增殖、凋亡及抗氧化功能的影響，以42 ℃作為熱應激溫度，37 ℃作為對照溫度，于42 ℃培養的乳腺上皮細胞分別添加不同質量濃度的富硒女貞子水煎液、齊墩果酸、蛋白質，采用MTT法檢測細胞增殖活性，流式細胞儀檢測細胞凋亡，黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性。結果表明，各質量濃度的富硒女貞子水煎液、齊墩果酸及蛋白質均能顯著提高熱應激狀態下乳腺上皮細胞的增殖活性(P<0.05)、顯著降低細胞的凋亡率(P<0.05)、顯著提高細胞培養上清中SOD的活性(P<0.05)，且富硒女貞子組明顯優于普通女貞子組。結果提示，富硒女貞子水煎液、齊墩果酸及蛋白質對熱應激引起的乳腺細胞增殖活性降低及細胞凋亡有明顯的改善作用，并能提高熱應激狀態下乳腺細胞的抗氧化功能。

熱應激；硒；女貞子；凋亡；乳腺上皮細胞

熱應激是指機體應對環境高溫所產生的非特異性應答反應[1]，近年來對熱應激的研究已達到細胞水平。不少研究發現[2-3]，高溫會導致乳腺上皮細胞增殖活性降低且誘導其凋亡。補中益氣類中草藥大多具有抗氧化、緩解機體熱應激的功效，馬得瑩等將女貞子作為飼料添加劑有效改善了熱應激下蛋雞的生產性能及抗氧化功能，減輕熱應激對蛋雞的危害[4]。但目前將中草藥用于細胞熱應激方面的報道很少，本試驗通過對體外培養乳腺上皮細胞進行高溫處理，并添加富硒女貞子及其主要成分，從細胞的生長和凋亡方面來探索富硒女貞子對乳腺細胞熱應激的干預作用，為闡明富硒女貞子抗熱應激的分子機制打下基礎。

1 材料與方法

1.1 主要細胞與試劑

MCF-7人乳腺上皮細胞，購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；富硒女貞子(硒含量1.88 μg·g-1)、對照藥女貞子由本實驗室保存提供[5-6]；改良型RPMI-1640培養基(HyClone)；胎牛血清(銀香國際)；胰蛋白酶-EDTA消化液(Solarbio)；四唑藍(MTT，Sigma公司)，臨用前配成5 mg·mL-1，漩渦混合儀混勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，4 ℃避光保存；二甲基亞砜(DMSO，天津市科密歐化學試劑有限公司)；FITC Annexin V 凋亡試劑盒(BD公司)。

1.2 主要儀器

核酸蛋白濃度檢測儀(美國伯騰儀器有限公司)；CO2培養箱(美國Revco公司)；倒置顯微鏡(重慶光學儀器廠產品)；超凈工作臺(蘇州凈化設備廠，SWcg1F)；MP200A分析天平(上海精密科學儀器有限公司)；XW-80微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)；FACS Aria 流式細胞儀。

1.3 試驗方法

1.3.1 藥物制備 精確稱取女貞子粉末，提取富硒女貞子蛋白質[7]、齊墩果酸[8]，臨用前配制好工作濃度，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。富硒女貞子水煎液中硒含量為1.77 μg·g-1(普通女貞子水煎液硒含量為0.225 μg·g-1)，富硒女貞子齊墩果酸中含硒量為4.9 ng·g-1(普通女貞子中齊墩果酸的含硒量為0.3 ng·g-1)，富硒女貞子中蛋白質的含硒量為0.681 μg·g-1(普通女貞子中蛋白質的含硒量為0.014 μg·g-1)[9]。

1.3.2 乳腺上皮細胞活率測定 將乳腺上皮細胞以1.5 ×105·mL-1的量接種于96孔板中，每孔100 μL，37 ℃ 培養12 h，觀察每孔細胞貼壁80%～90%后分組試驗。設3大組：37 ℃對照組、42 ℃熱應激組、42 ℃給藥組，每組4個重復，其中給藥組分為富硒女貞子水煎液、蛋白質、齊墩果酸組以及普通女貞子水煎液、蛋白質、齊墩果酸組。給藥組換成含不同藥物的維持液(胎牛血清濃度為2%)，37 ℃對照組和熱應激組換成維持液，對照組37 ℃培養，熱應激組和給藥組置于42 ℃培養1、3、6、8 h后采用MTT法檢測各時間段內細胞的存活率。

1.3.3 SOD活性的測定 將乳腺上皮細胞以1×105·mL-1的量接種于6孔板中，每孔1 mL，37 ℃ 培養24 h，觀察每孔細胞貼壁80%～90%分組試驗，設3大組：37 ℃對照組、42 ℃熱應激組、42 ℃給藥組(同上)，每組6個重復。給藥組換成含不同藥物的維持液，37 ℃對照組和熱應激組換成維持液，對照組37 ℃培養，熱應激組和給藥組置于42 ℃培養3 h后放回37 ℃繼續培養12 h，然后收集細胞培養液上清，采用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)按照試劑盒說明書測定SOD活性。

1.3.4 細胞凋亡率的測定 將乳腺上皮細胞以4×105·孔-1的量接種于6孔板中，每孔1 mL，37 ℃ 培養12 h，觀察每孔細胞貼壁80%～90%分組試驗，設3大組：37 ℃對照組、42 ℃熱應激對照組、42 ℃給藥組(同上)，每組6個重復。培養給藥組換成含不同藥物的維持液，對照組和熱應激對照組換成維持液，對照組37 ℃培養，熱應激組和給藥組置于42 ℃培養3 h后采用Annexin V-FICT/PI試劑盒及流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.4 數據分析

2 結 果

2.1 富硒女貞子對熱應激乳腺上皮細胞增殖活性的影響

采用改良的MTT法檢測細胞增殖活性，結果表明：42 ℃的熱應激組細胞在培養1、3、6、8h后增殖活性均顯著低于37 ℃培養的常溫對照組(P<0.05)；與42 ℃熱應激組相比，各濃度的富硒女貞子水煎液組(圖1)、齊墩果酸組(圖2)、蛋白質組(圖3)均能顯著提高細胞的增殖活性(P<0.05)，且富硒組明顯優于普通女貞子組，其中富硒女貞子水煎液的作用效果為極顯著(P<0.01，圖中未標注)，當質量濃度達到8mg·mL-1時作用效果最佳，在熱應激1、3、6、8h后較熱應激組細胞增值率提高分別達80.9%、35%、40%、34.7%。

不同字母代表有顯著差異(P<0.05)，下同The data with different superscript letters in column differ significantly (P<0.05)，the same as below圖1 富硒女貞子水煎液對熱應激乳腺細胞增殖活性的影響Fig.1 The effect of water exact of se-LLF on mammary epithelial cells after heat treatment

圖2 富硒女貞子齊墩果酸對熱應激乳腺細胞增殖活性的影響Fig.2 The effect of oleanolic acid exact of se-LLF on mammary epithelial cells after heat treatment

2.2 富硒女貞子對熱應激乳腺上皮細胞SOD活性的影響

本試驗采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力，結果如表1所示：各質量濃度水平的富硒女貞子水煎液、齊墩果酸、蛋白質均顯著提高42 ℃熱應激下乳腺上皮細胞SOD的活性(P<0.05)，且水煎液、齊墩果酸、蛋白質濃度分別達到8 mg·mL-1、10 μg·mL-1及800 μg·mL-1時作用效果最佳，與熱應激組差異極顯著(P<0.01)。此外，8、10 mg·mL-1的富硒女貞子水煎液提高SOD活性的作用效果極顯著優于普通女貞子(P<0.01)，各濃度富硒女貞子蛋白質和齊墩果酸提高SOD活性的作用效果優于普通女貞子，但差異不顯著(P>0.05)。

圖3 富硒女貞子蛋白質對熱應激乳腺細胞增殖活性的影響Fig.3 The effect of protein exact of se-LLF on mammary epithelial cells after heat treatment

表1 富硒女貞子對熱應激乳腺上皮細胞SOD活性的影響

Table 1 The effect of se-LLF on antioxidant activity of mammary epithelial cells after heat treatment

U·mL-1

同列肩注小寫字母表示不同組別與對照組的比較；同列肩注大寫字母表示富硒女貞子與女貞子的比較。同列肩注相同字母差異不顯著(P>0.05)，同列肩注相鄰字母差異顯著(P<0.05)，同列肩注相間字母差異極顯著(P<0.01)；其中水煎液低、中、高劑量分別為5、8、10 mg·mL-1，齊墩果酸為5、10、20 μg·mL-1，蛋白質為400、800、1 000 μg·mL-1(下同)

The same column shows a comparison of the shoulder note uppercase different groups and the control group；note the shoulder with lowercase letters column comparison with SeLigustrumlucidum's.Note the shoulder with the same letter column is no significant difference (P> 0.05)，note adjacent letters column shoulder with significant differences (P<0.05)，note the shoulder with white letters out significant difference (P<0.01).The low，medium and high concentration of water extract of se-LLF are 5，8 and 10 mg·mL-1.The low，medium and high concentration of oleanolic extract of se-LLF are 5，10 and 20 μg·mL-1.The low，medium and high concentration of protein extract of se-LLF are 400，800 and 1 000 μg·mL-1(The same as below)

2.3 富硒女貞子對熱應激乳腺上皮細胞凋亡的影響

本試驗采用細胞流式術檢測細胞凋亡，結果如表2所示，37 ℃培養時，細胞狀態良好，凋亡細胞僅為細胞總數的2.8%，42 ℃熱應激3 h細胞凋亡率極顯著上升達到14%(P<0.01)。與42 ℃熱應激組相比，各質量濃度水平的富硒女貞子水煎液、齊墩果酸、蛋白質均能極顯著降低細胞凋亡率(P<0.01)，其中8 mg·mL-1的富硒女貞子水煎液、10 μg·mL-1的齊墩果酸以及800 μg·mL-1的蛋白質作用效果最佳，降低細胞凋亡比例分別達到74%、66%及68%。此外，8 mg·mL-1的富硒女貞子水煎液、5 μg·mL-1的齊墩果酸以及400 μg·mL-1的蛋白質降低細胞凋亡率的作用效果顯著優于普通女貞子(P<0.05)，其他質量濃度的富硒女貞子水煎液、齊墩果酸和蛋白質降低細胞凋亡率的的作用效果亦優于普通女貞子，但差異不顯著(P>0.05)。具體凋亡圖譜見圖4a～t。

(圖4，轉下頁)

(Fig.4，continued on the next page)

(接上頁)

(Continued)

a.37 ℃對照組；b.42 ℃熱應激組；c～e.富硒女貞子水煎液組，分別為5、8、10 mg·mL-1；f～h.普通女貞子水煎液組，濃度同富硒女貞子水煎液組；i～k.富硒女貞子齊墩果酸組，分別為5、10、20 μg·mL-1；l～n.普通女貞子齊墩果酸組，質量濃度同富硒女貞子齊墩果酸組；o～q.富硒女貞子蛋白質組，分別為400、800、1 000 μg·mL-1；r～t.普通女貞子蛋白質組，質量濃度同富硒女貞子蛋白質組a.37 ℃ contrast group；b.42 ℃ heat stress group；c-e.Water extract of se-LLF groups (5，8，10 mg·mL-1)；f-h.Water extract of LLF groups (5，8，10 mg·mL-1)；i-k.Oleanolic extract of se-LLF groups (5，10，20 μg·mL-1)；l-n.Oleanolic extract of LLF groups(5，10，20 μg·mL-1)；o-q.Protein exact of se-LLF groups (400，800，1 000 μg·mL-1)；r-t.Protein exact of LLF groups (400，800，1 000 μg·mL-1)圖4 流式細胞儀檢測各組乳腺上皮細胞的凋亡圖譜Fig.4 Apoptosis chart of cultured mammary epithelial cells detected of different group by flow cytometry

表2 富硒女貞子對熱應激乳腺上皮細胞凋亡的影響

Table 2 The effect of se-LLF on apoptosis of mammary epithelial cells after heat treatment %

水煎液WaterexactofLLF齊墩果酸Oleanolicacid蛋白質Protein富硒Se-enriched普通Ordinary富硒Se-enriched普通Ordinary富硒Se-enriched普通Ordinary低5.50±0.23cA6.10±0.38cdA7.80±0.44dA11.60±0.32dB6.80±0.1dA10.70±0.55dB中3.70±0.18bA5.20±0.52cB4.70±0.67bA5.30±0.19cA4.50±0.72cA5.70±0.89cA42℃高5.10±0.21cA5.40±0.29cA5.70±0.28cA6.30±0.84cA6.30±0.13dA7.00±0.47cA對照14.00±0.33f37℃2.80±0.15a

3 討 論

3.1 富硒女貞子能提高熱應激乳腺上皮細胞SOD活性

在正常情況下，機體內活性氧(ROS)自由基的產生、利用、清除保持著動態的平衡。當機體處于熱應激狀態時，體內ROS的量會相對升高，超過機體的清除能力，引起細胞DNA氧化損傷。SOD廣泛存在于生物體內，能維持機體中自由基產生和清除動態平衡，是一種重要的抗氧化酶，因此SOD活性能間接地反映機體清除氧自由基的能力。有報道稱，女貞子水提物可提高肉仔雞血清和組織中SOD活性[13]，從而提高肉雞的抗氧化功能。硒作為體內抗氧化酶系的組分，以直接清除自由基和影響非酶類抗氧化劑的代謝等方式在體內發揮重要的抗氧化作用，硒的抗氧化功能是其他生理功能的基礎[14]，研究表明[15-16]，在飼料中添加一定量的硒可以有效地改善熱應激狀態下動物的抗氧化性能，并能提高機體的抵抗力。本研究佐證上述研究結果，富硒和普通女貞子及其主要成分均能提高熱應激乳腺上皮細胞的抗氧化功能，女貞樹通過花果葉面噴施硒肥而收獲的富硒女貞子藥材中硒含量顯著提高，硒和女貞子協同作用，使得富硒女貞子的效果明顯優于普通女貞子。

3.2 富硒女貞子能提高熱應激乳腺上皮細胞增殖活性

本研究中，42 ℃熱應激組乳腺上皮細胞增殖活性始終顯著低于37 ℃對照組，這表明高溫對乳腺上皮細胞的生長造成嚴重的損傷，這與多人的研究結果一致[9-10]。研究發現在熱應激條件下，細胞功能產生許多的異常，包括對蛋白質合成的抑制、蛋白質結構和功能的缺失、新陳代謝的改變、細胞膜結構的改變，從而減少了細胞的增殖[11-12]。在添加富硒女貞子水煎液及其主要成分后，有效緩解了高溫對乳腺上皮細胞增殖活性的抑制，其中富硒女貞子水煎液及齊墩果酸促進熱應激乳腺細胞增殖效果甚至明顯高于37 ℃常溫對照組。這表明富硒女貞子能顯著提高熱應激對乳腺上皮細胞增殖活性的影響，使其恢復到正常水平，并以8 mg·mL-1的富硒女貞子水煎液的效果最佳，這種作用與提高細胞SOD活性的趨勢一致。推測，富硒女貞子促進細胞在熱應激狀態下的增殖活性可能與其提高細胞SOD活性有關，其作用機制還需進一步研究。

3.3 富硒女貞子能降低熱應激乳腺上皮細胞凋亡率

高溫誘導體外培養細胞凋亡已被許多學者證實，高溫會導致細胞線粒體損傷，釋放促凋亡因子，誘導細胞發生凋亡[17-18]。本研究采用流式細胞儀檢測細胞凋亡，結果表明高溫顯著促進細胞凋亡，添加富硒女貞子水煎液及其主要成分后，有效降低細胞凋亡率。有報道稱，細胞內活性氧(ROS)水平的輕微增高促進細胞的增殖和分化，而胞內ROS水平的顯著增高則快速觸發細胞的凋亡[19]，而SOD活性以及抗ROS活力與細胞凋亡率呈負相關[20]。由此推斷，富硒女貞子可能是通過提高細胞SOD活性，改善細胞在熱應激狀態下的抗氧化功能從而降低細胞的凋亡率。

綜上所述，富硒女貞子水煎液、齊墩果酸及蛋白質均能提高熱應激狀態下乳腺細胞的抗氧化功能，對熱應激引起的乳腺細胞增殖活性降低及細胞凋亡有明顯的改善作用。

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(編輯 白永平)

Influence of Se-enrichedLigustrumlucidiumFruit on Proliferation，Apoptosis and Antioxidant Activity of Mammary Epithelial Cells under Heat Stress

ZOU Hui1，2，LI Dan-dan1，2，CHEN Jing1，2，LAO Xue-fen1，2，CAO Zheng1，2，SHANG Qiu-chen1，2，XU Xiao-qin1，2*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China；2.JiangsuCo-innovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses，Yangzhou225009，China)

The experiment was conducted to study the effects of se-enrichedLigustrumlucidiumFruit on proliferation，apoptosis and antioxidant activity of mammary epithelial cells cultured under heat circumstanceinvitro.The heat stress model temperature was set as 42 °C and the temperature 37 °C was set as the control.In the experiment，heat-stressed mammary epithelial cells were cultured with different concentration of water extract，protein and oleanolic acid extract of Se-LLF.The growth and apoptosis rate of cultured mammary epithelial cells were detected by MTT and flow cytometry，respectively，and the content of SOD in the supernatant fluid of cultured mammary epithelial cells was detected by xanthine oxidase.The results showed that the proliferation of mammary epithelial cells cultured under high temperature was significantly promoted in each experimental concentration of water extract，protein and oleanolic acid extract of Se-LLF (P<0.05).The apoptosis rate decreased significantly (P<0.05)，the activity of SOD (P<0.05) was increased significantly，and the results were better than those of the ordinaryLigustrumlucidumgroup.In conclusion，water extract，protein and oleanolic acid extract of Se-LLF can not only improve the proliferation and apoptosis rate of heat-stressed mammary epithelial cells，but also improve their antioxidant capacity.

heat stress；selenium；FructusLigustriLucidi；apoptosis；mammary epithelial cells

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.022

2014-09-19

國家自然科學基金(31172354)；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目；江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心資助項目

鄒 慧(1989-)，女，江蘇蘇州人，碩士生，主要從事中草藥藥理作用與獸醫臨床應用的研究，E-mail：zouhui1314@126.com

*通信作者：許小琴，教授，主要從事中獸醫醫藥科學研究，E-mail：xuxq@yzu.edu.cn

S853.74

A

0366-6964(2015)06-1047-08