杜氏肌營養不良癥的表達譜分析

曹軍華 田禮軍 鄧星強 張傳玲 錢同 宋賢響 黃寶山

獨立行走能力［2］，在20歲左右死于呼吸系統衰竭［3］。認知缺陷也是該病的特征之一［4］。雖然患者自出生起一直存在肌肉缺陷，但是DMD患者在出生的臨床表征是正常的。DMD患者最初的癥狀多在2～5歲時有所表現，癥狀包括行走滯后于同齡人、經常摔倒、奔跑或者爬樓梯困難等［5，6］。因此，患者最初的兩年被認為臨床癥狀前階段［7］。在DMD基因被發現以來的20多年內，研究者提出了很多有前景的治療方法［8，9］。但是，這些方法有很多困難需要克服，目前該病仍無藥可醫。雖然DMD基因的突變是改變的首要原因，但是其他因素也可能與該病的病理過程相關。患者的次級變化涉及細胞因子［10］、一氧化氮合成酶［11］、代謝異常［12］、生長因子［13］、鈣平衡［14］和肥大細胞脫顆粒作用［15］等過程，表明DMD的病理過程非常復雜，很多生化代謝通路可能與疾病進程相關。現有的高通量技術

杜氏進行性肌營養不良癥(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是一種因X染色體的肌營養不良蛋白基因發生突變而導致的以肌肉纖維化和中樞神經系統異常為特征的一種嚴重的進行性疾病。每年約有1/3 500的男性新生兒罹患DMD［1］。肌營養不良蛋白是一個427 kDa細胞骨架蛋白，位于肌纖維膜底部，與肌纖維膜蛋白共同構成肌營養不良蛋白相關蛋白復合物 (dystrophin-associatedproteincomplex，DAPC)。DAPC的缺失和缺陷會導致慢性炎癥，進行性肌肉衰退和肌肉纖維化［2］。DMD患者通常在13歲之前喪失使得同時研究成千上萬個基因的表達狀況成為可能，為研究DMD的疾病發生機制提供了極大的便利。我們認為，異常的代謝通路與疾病的特定階段相關。富集了差異表達基因的代謝通路可能在疾病進程過程起到重要作用。本研究中，我們對從基因表達數據庫(gene expression omnibus，GEO)下載的兩個表達譜芯片數據進行了分析，旨在鑒定出與發病階段相關的代謝通路。此外，在不同發病階段表達狀況不同的基因分析也可能為以后的診療研究提供可靠的靶標。

1 材料與方法

1.1 芯片數據 我們從GEO數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下 載 了 兩 個 數 據 集 合(GSE6011 and GSE3307)，共包含19名癥狀發生前的患者，8名癥狀發生后的患者和14名健康對照。兩個數據集均基于GPL96平臺，使用Affymetrix Human Genome U133A芯片。這些樣本收集于2005至2006年間，由研究者在其文章發表后上傳于GEO數據庫。見表1。

表1 樣本信息

1.2 差異表達基因分析 我們下載了41個個體的CEL格式和SOFT格式的文件。原始數據采用multiarray analysis(RMA)［16］方法進行標準化，步驟如下:(1)去除背景噪音;(2)表達值標準化;(3)針對每個探針產生相應的表達值。t檢驗被用來檢測在不同組中的差異表達基因(閾值0.01)，Benjamini和 Hochberg法(Benjamini and Hochberg)被用來進行多重檢驗校正。與正常對照相比，癥狀發生前患者的差異表達基因和癥狀發生后患者的差異表達基因被檢測出來。基因表達的上下調由表達量的差異確定。所有分析過程均在 R 軟件(v2.14.1)中選用 BioConductor，limma 包(3.12.1)和庫［17］。

1.3 通路富集分析 差異表達的探針通過SOFT格式文件進行注釋。所有的基因均映射到KEGG通路數據庫中 (http://www.genome.jp/kegg/)。我們采用超幾何分布檢驗來檢測存在差異表達基因富集的通路。

2 結果

2.1 癥狀發生前呈現差異表達基因富集的通路 與健康對照相比，在癥狀發生前的患者中，有1023個基因差異表達。其中，747個基因表達量上調，276個基因表達量下調。對于癥狀發生后的患者，1 407個基因差異表達，其中，977個基因表達量上調，430個基因表達量下調。共5 157個基因可以映射到KEGG數據庫中。差異表達的基因中，癥狀發生前差異表達基因有494個可以映射到KEGG數據庫，癥狀發生后差異表達的基因有619個可以映射到KEGG數據庫中。富集分析的結果表明，在癥狀發生前的個體中，有41個通路富集了差異表達基因。在癥狀發生后的患者中，有33個通路富集了差異表達基因。在這些通路中，有11個通路僅在癥狀發生前發現，其中9個與代謝相關。見表2。

表2 僅在癥狀發生前呈現出差異表達基因富集的通路

2.2 癥狀發生前后均呈現差異表達基因富集的通路 有3個通路僅在癥狀發生后的患者中被鑒別出來，包含細菌入侵上皮細胞通路、緊密連接通路、D型谷氨酰胺和D型谷氨酸代謝通路。30個通路是兩個階段的患者共有的，其中包含兩個DMD基因參與的通路，擴張型心肌病通路(hsa05414)和病毒性心肌炎通路(hsa05416)。見表3。

表3 在癥狀發生前后均呈現出差異表達基因富集的通路

2.3 相互作用 這些通路之間存在著相互關系，一些在不同階段差異表達的基因。見圖1、2。

圖1 差異表達基因富集的通路間的相互作用關系。a:癥狀發生前;b:癥狀發生后。僅顯示KEGG數據庫中與其他通路存在相互作用關系的通路

圖2 DMD病理過程圖示，僅展示了與肌肉重建和鈣平衡維護相關的差異表達基因。由過表達的基因編碼的蛋白質用紅色顯示，低表達的由綠色顯示，黑色代表沒有差異表達;DHPR是心肌特異性的，在心肌細胞中，RYR基因(RYR2)并沒有差異表達

3 討論

DMD的疾病進程比較復雜。因肌營養不良基因突變引起的次級過程包括肌纖維膜的破壞、鈣平衡失調、肌肉壞死和衰竭［18］，同時伴隨著脂肪組織的增殖和免疫細胞的浸潤等［3］。這些下游的通路可能與疾病進程相關，但是無法單獨闡明DMD的發病進程。現有的芯片技術使得同時研究很多mRNA的差異表達成為可能。富集了差異表達基因的生化通路可能在DMD的發病進程中起到非常重要的作用。我們利用從GEO數據庫下載的兩套數據對不同發病階段的差異表達基因和異常通路進行了分析。

結果表明，兩個發病階段共有超過70%的異常通路，表明很多通路異常在患者中是一直存在的，不論其是否表現出臨床表型。如圖1所示，很多通路設計免疫系統，包括炎癥/免疫反應、免疫性疾病、免疫系統和傳染病。這些免疫相關的通路的異常可能與免疫細胞的滲透相關，包含 T 細胞［19，20］、巨噬細胞［19，20］、嗜酸細胞［21］和肥大細胞［22，23］。這些免疫性細胞的滲透會導致很多炎性細胞因子水平的升高。以往的研究表明在小鼠模型中降低CD4或者 CD8 T cells［24］或者巨噬細胞［25］的水平可顯著緩解小鼠的DMD表型，延緩其發病進程［26］。與以往的研究［27］一致，共有免疫或炎癥相關的通路表明患者出生后不久炎癥級聯反應即已啟動。但是，有些基因在癥狀發生后表現出比癥狀發生前更高或者更低的差異表達，這些差異可能與其臨床表現相關。

因肌營養不良蛋白缺失而導致的肌纖維膜完整性的喪失會知道肌肉對損傷的敏感性增高，導致炎癥發生，同時啟動肌肉重建過程。另外，以往的研究［3，18，28－30］表明細胞外鈣離子的流入可能會導致隨后的肌肉壞死和細胞凋亡。因此，我們針對肌肉重建過程和鈣離子平衡維護過程中的基因的表達情況進行了進一步分析。

肌肉重建過程中，纖維化的進程可能在兩個階段差異不大。主要的纖維形成膠原蛋白(Ⅰ型和Ⅲ)和其他纖維膠原(Ⅴ型)在兩個階段均呈現出過表達。但是，如圖2所示，NOS1的差異表達僅在癥狀發生后的病人中檢測到。該基因的低表達可能會導致一氧化氮自由基的表達降低，而一氧化氮自由基可以保護肌肉免受氧化損傷［31］，并且可激活肌肉衛星細胞［32］。以往的研究表明，在肌營養不良小鼠中維持正常水平的NOS，可以降低肌肉中巨噬細胞的濃度，從而起到預防肌肉膜損傷的作用，同時可降低肌酸激酶的濃度［25］。大量肌酸激酶的釋放會引起相應的炎性反應。我們注意到肌肉肌酸激酶的活性在癥狀發生前的患者中表達水平是降低的，說明NOS在癥狀發生前可能功能是正常的，可激活正常的肌肉重建過程，預防進一步的肌肉損傷。因此，NOS的異常表達可能與DMD的疾病進程相關。此外，抑制NOS活性的二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶2(dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2，DDAH2)在兩個階段的患者中均呈現出過表達。但是過表達的水平在癥狀發生后(0.55～0.58)略高于癥狀發生前(0.37 ～0.46)，這說明 NOS的表達水平降低可能與DDAH2的表達水平升高有關。

對鈣平衡來說，隨著細胞外鈣離子通過肌營養不良蛋白缺陷膜的涌入，肌質網(sarcoplasmic reticulum，SR)鈣泵細胞膜上的納鈣交換泵(sodium/calcium exchanger，NCX)和鈣離子-ATP酶泵(Plasma membrane Ca2+-ATPase，PMCA)可起到降低胞內鈣離子濃度的作用。我們的研究表明，與NCX和PMCA相關的基因均沒有差異表達。但是，如圖2所示，肌質/內質網鈣腺苷三磷酸酶(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase，SERCA)和受磷蛋白 (phospholamban，PLN)在癥狀發生前表現出低表達。PLN/SERCA實際上降低了因為PLN的表達的降低量(－1.00419)大概是SERCA(ATP2A1:－0.50584;ATP2A2:－0.55769)的兩倍。SERCA的活性受PLN的調控，在PLN去磷酸化時可以與SERCA相互作用從而抑制其活性［33］。蛋白激酶(protein kinase-A，PKA)可促使PLN磷酸化，從而取消對SERCA的抑制作用，增加其對鈣離子的親附性。PLN/SERCA比率的降低可促進SERCA對將鈣離子吸收到內質網的作用［34］。因此，在癥狀發生前的患者中，PKA的過表達以及PLN/SERCA比率的降低可能會加速PLN的磷酸化，解除對hSERCA的抑制，促進鈣離子從胞質進入內質網，從而降低胞質鈣離子的濃度。而CACNA1D和CACNA1B基因僅在癥狀發生后的患者中呈現出低表達。他們所表達的蛋白是二氫吡啶受體(dihydropyridine receptors，DHPR)的亞基，可與阿諾堿受體(ryanodine receptors，RYR)結合并抑制內質網釋放鈣離子［35］。這兩個基因的低表達可能會解除DHPR的一直作用，從而導致胞質鈣離子濃度升高。在兩個階段的患者中，肌肉中的 RYR基因RYR1均呈現出低表達。但是SERCA對鈣離子的親和性可能在癥狀發生后降低因為PLN/SERCA的比率在癥狀發生后沒有改變。因此，鈣離子濃度的維持方面，癥狀發生前的患者可能優于癥狀發生后的患者。DHPR，PLN/SERCA可作為以后研究的靶點。

總之，我們針對DMD癥狀發生前患者和癥狀發生后患者的表達譜進行了分析以獲得疾病進行過程中的作用機制。結果表明，兩個階段共有很多炎癥相關的異常通路，說明疾病早期炎癥級聯反應已開始發生。另外，在兩個階段的特異性方面，我們發現癥狀發生前病人在肌重建過程和心肌鈣平衡維持方面的表現優于癥狀發生后的患者。我們的研究為進一步了解DMD的疾病進程機制和以后的治療方法研究奠定了基礎。

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