頸動脈分叉部動脈瘤模型形態學、血流動力學和組織病理學研究

李 菁， 王 玨， 譚華橋

血管分叉部動脈瘤，如顱內動脈瘤，有較高患病率［1］，并能導致致命性出血，然而其發生發展、破裂的具體機制目前尚未明確［2-3］。血流動力學改變和血管壁損傷在顱內動脈瘤發生中起重要作用；近80%顱內大血管分叉部存在動脈壁肌層缺失。有研究證實動脈分叉頂部動脈瘤存在由復雜的管壁面切應力（WSS）或管壁面切應力梯度（WSSG）所引起的細胞及分子水平改變［3］。但僅有少數動物模型較滿意地模擬了分叉部動脈瘤發生及生長［4］。我們假設內層彈力膜（IEL）及中膜彈力纖維損傷和特定血流動力學行為可促進動脈瘤發生和發展，設計制作一種犬頸總動脈（CCA）Y形分叉模型并以彈力蛋白酶消化分叉部頂端，從血管造影和組織病理水平動態觀察動脈瘤生長。

1 材料與方法

本實驗研究方案經上海交通大學附屬第六人民醫院動物研究委員會批準，并遵循國際動物保護協會指導方針。取用21只8個月齡比格犬，體重12～20 kg（上海交通大學農學院提供，許可證：SCXK2007-0004）。

1.1 動物模型制作及分組

取18只犬，按Meng等［5］報道方法制作CCA Y形分叉模型，隨后隨機分為彈力蛋白酶處理組（EBG組）和分叉模型對照組（CBG組），每組雌性犬6只和雄性3只。EBG組通過彎曲的注射器鈍頭將彈力蛋白酶（3.0 U/μl）滴入T形塑料管并流入模型分叉部頂端（面積約4×4 mm2）15 min，防止流入血管其它區域；CBG組以同樣方法換用生理鹽水流入模型分叉部頂端。上述步驟前應盡量多地去除血管外膜，以方便彈力蛋白酶或鹽水滲透。另取3只犬，直段CCA切開暴露并以彈力蛋白酶處理（ESG組）。用彩色多普勒超聲儀采集模型建立前后目標血管收縮期峰值流速。

1.2 血管造影分析

術后即刻、術后12周和24周，采用德國Siemens公司Syngo AXIOM-Artis型數字減影血管造影機作血管造影檢查。如果有動脈瘤樣囊泡形成，即依據三維DSA圖像分別測量頸和瘤體最大值、載瘤動脈直徑和角度。術后第4周和第8周，采用超聲儀動態監測動脈瘤是否形成及其大小，觀察模型分叉情況。

1.3 流體動力學分析

術后即刻、術后12周和24周，采用三維DSA作旋轉性血管造影并對模型分叉部三維成像，測得分叉部血流流速作為邊界條件，引入計算流體動力學（CFD）模擬軟件（Mimics 10.0圖像處理軟件，比利時Materialise公司）分析WSS（橫向力）、流速場、流速曲線、表面相對壓力場（縱向力）、總壓力場并計算WSSG，同時分別在CCA分叉頂部同側相距1、2、3mm處定量分析EBG組分叉模型WSS和WSSG。

1.4 組織病理學檢查

術后 12周（n＝6）和 24周（n＝3）分別取 EBG組、CBG組CCA Y形分叉模型樣本，術后24周取ESG組（n＝6）CCA樣本。預實驗和術后分叉樣本均作蘇木精-伊紅（HE）、Masson染色和彈力纖維染色。連續切片用于評估分叉樣本組織學改變，用EnVision快速微波免疫組化標記技術，以小鼠抗增殖細胞核抗原（PCNA）抗體、α-平滑肌肌動蛋白（SMA）單克隆抗體、抗巨噬細胞單克隆抗體（MAC387）、基質金屬蛋白酶（MMP）-2和MMP-9單克隆抗體為CCA樣本作免疫標記；用抗CD45的白細胞抗體和抗MAC387的抗巨噬細胞抗體作免疫雙熒光染色，判斷白細胞中是否包含巨噬細胞；測量平滑肌細胞增殖率（PCNA陽性平滑肌細胞所占比例）、彈力層和肌動蛋白陽性平滑肌層厚。炎性細胞浸潤指數為CD45陽性細胞在血管分叉中膜有核細胞中所占百分比，MMP-2和MMP-9表達水平定義為MMP-2/9陽性區域在血管分叉中膜中所占面積百分比。采用Image-Pro Plus 6.0版圖像分析系統軟件（美國Media Cybernetics公司）作組織病理學圖像統計分析，每個切片至少隨機選擇20個以上高倍鏡視野（400倍）進行分析。

1.5 統計學分析

采用GraphPad Prism 5.0軟件（美國GraphPad微軟公司）進行統計學分析。連續變量用平均值±標準差表示，數值變量以數量或百分比表示；用確切概率法（Fisher檢驗）比較分類資料；用組間t檢驗比較平滑肌細胞增殖速率、彈力層、肌動蛋白陽性平滑肌層厚、炎性細胞浸潤程度、MMP-2和MMP-9表達水平。所有數據均經雙邊檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動物模型及血管造影結果

成功建立所有犬CCA Y形分叉模型。超聲或血管造影檢查均顯示無吻合口狹窄、無載瘤動脈閉塞。血管造影顯示EBG組5只犬模型有CCA分叉頂部新生動脈瘤形成，其中4只為雌性，1只為雄性（P＞0.05）；二維和三維DSA均顯示動脈瘤位置在分叉頂部，形態為寬基底型，瘤體平均直徑（3.2±0.4）mm，瘤頸（6.7±2.3）mm（圖1）；術后24周未觀察到動脈瘤破裂，較12周時僅有輕度增大，（3.5±0.3）mm對（3.2±0.4）mm（P＝0.076）。術后4周超聲監測均已發現所有新生動脈瘤。CBG組12周時血管造影未顯示任何形態學改變。載瘤動脈直徑和角度在CBG組分別為（4.3±0.4）mm和（112.9±36.1）°，EBG組分別為（4.3±0.4）mm和（120.3±44.2）°（表1）。EBG組5只形成動脈瘤模型載瘤CCA分叉角度為（146.8± 40.8）°，4只未形成動脈瘤者分叉角度為（87.25± 18.87）°（P＝0.032）。

圖1 術后二維、三維DSA隨訪圖像和大體解剖圖

表1 3組犬模型相關信息總結

2.2 動脈壁組織學改變

活體組織觀察形成動脈瘤的5個CCA分叉樣本，發現整個血管壁變薄，呈半透明狀態，并能觀察到內部血流，因而易致使變薄的血管壁膨出，形成分叉部動脈瘤。HE、Masson染色顯示 ESG組和EBG組分叉部中膜變薄，平滑肌細胞減少，纖維連接缺失。彈力纖維染色顯示ESG組和EBG組IEL不連續，彈力纖維斷裂；CBG組3只犬CCA分叉頂部出現內膜輕度損傷。彈力蛋白酶作用降低了中膜彈力纖維層厚，在EBG組、ESG組和CBG組分別為（21.2±15.3）μm、（71.3±19.5）μm和（119.4±29.9）μm（P＜0.001）。

免疫組化染色顯示，EBG組CCA分叉頂部血管壁α-SMA陽性平滑肌細胞數量減少，PCNA陽性平滑肌細胞數比例明顯增加，為（42.0±15.7）%對ESG組（7.3±3.8）%、CBG組（8.0±6.3）%，P＜0.001；平滑肌層變薄，（31.3±16.7）μm對ESG組（136.5±25.5）μm、CBG組（133.9±26.1）μm，P＜0.001（圖2）；血管壁炎性細胞浸潤程度為（38.4±10.6）%，與ESG組（5.1± 2.1）%、CBG組（2.9±2.4）%相比，P＜0.001。巨噬細胞染色顯示，EBG組血管壁內有巨噬細胞浸潤，分布與白細胞相似。EBG組動脈瘤壁MMP-2表達水平為（21.0±8.7）%，與ESG組（1.2±1.4）%、CBG組（0.8± 1.2）%相比，P＜0.001；MMP-9表達水平為（13.6±5.6）%，與ESG組（0.9±0.8）%、CBG組（0.4±0.6）%相比，P＜0.001（圖3）。

圖2 動脈壁組織學改變

2.3 CFD分析

結扎對側CCA后，分叉載瘤CCA內血流速度由（85.3±7.5）cm/s增長至（128.8±13.1）cm/s。術后CFD分析顯示CBG組和EBG組載瘤動脈壁WSS增高，分叉根部區域處于更為復雜的血流動力學環境；分叉頂部WSS減低、血流速度減慢，沿分叉頂部往兩側WSS和血流速度均先增大至最大值，而后下降至與直段動脈相近；分叉頂部相對壓力和總壓力最高，然后再向動脈分支方向減低至正常值。

術后即刻和術后24周ESG組、CBG組與EBG組中4只未出現形態學改變的模型WSS、血流速度、流線場、表面相對壓力場和總壓力場參數相似（圖4①）。定量分析EBG組中5只產生動脈瘤模型WSS和WSSG顯示，術后24周發生明顯下降，2mm處平均WSS由（13.74±2.82）Pa/mm降至（5.48±1.14）Pa/mm（P＜0.01），1 mm處WSSG由（7.19±3.87）Pa/mm降至（0.85±1.12）Pa/mm（P＝0.01），致使囊狀動脈瘤形成（圖4②③），隨訪過程中相對壓力和總壓力也降低；EBG組動脈瘤形成模型WSS（多在2 mm處）、WSSG（0～2mm處）值通常較無動脈瘤形成模型高（圖4④）。具有較高WSS、WSSG值的血管壁經血管造影和組織學檢查證實均有管壁再塑形改變。由于形成動脈瘤的分叉模型角度較大，分叉頂部鄰近血管壁往往有較高的WSS、WSSG值。

圖3 免疫組化染色定量炎性增殖細胞（CD45+/MAC387+）顯示MMP-2和MMP-9表達

圖4 CBG組和EBG組術后12周、24周CFD分析

3 討論

對動脈瘤發生發展病理學機制的深入研究，使得建立數學模型分析血管性病變發展成為可能。2007年，Meng等［5］通過建立CCA Y形分叉模型發現，高WSS或WSSG值與組織學損傷有關，而管壁損傷并未發展成為動脈瘤。2008年，Gao等［6］通過結扎兔雙側頸內動脈改變血流動力學引發了顱內新生動脈瘤，這與基底動脈血流增加有關。還有一些研究顯示動脈分叉部復雜的血流動力學可誘發與人體動脈瘤形成類似的分子水平改變，如高WSS、WSSG區域內皮型一氧化氮合酶（eNOS）減少，CD68缺乏，MMP-2、MMP-9、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、白細胞介素（IL）-1β增加［3-4，7］，這表明血流動力學改變從分子水平可能促進了動脈瘤形成。

許多研究證明，除持續血流外，導致血管壁退化的因素是顱內動脈瘤發生的最重要環節［8］。我們在實驗中通過彈力蛋白酶誘發IEL和中膜彈力纖維損傷導致血管壁退化，血流沖擊引發肌層退化，建立分叉模型模擬分叉部血流動力學環境，結扎對側CCA增加血流流速，旨在觀察CCA分叉部血流動力學改變伴血管壁退化、血流流速增加對犬動脈瘤發生的作用。前期實驗中我們發現用彈力蛋白酶消化血管壁內膜極易導致血栓形成，故改用消化外膜方式選擇性損傷IEL和彈力纖維模擬血管壁退化；結果表明，犬頸動脈分叉模型頂端經彈力蛋白酶消化所致動脈壁退化可引起新生動脈瘤形成［9］。本實驗很關鍵的是，通過盡可能多去除外膜來加強彈力蛋白酶滲透。

術后24周血管造影及組織病理學檢查確認EBG組5/9犬模型成功誘發動脈瘤，因而動脈壁退化加上血流動力學改變可能會有效地誘發動脈瘤。動脈瘤發生及增大是血管壁重塑的一種形式，通過炎性細胞浸潤、MMP活動性增加、細胞外基質蛋白合成及平滑肌細胞凋亡抵消了血流改變引起的機械力刺激［10］。炎性細胞浸潤表現為動脈壁中膜出現抗CD45抗體染色泛白細胞，在人和動物顱內動脈瘤內也可觀察到這一改變［11］，證明炎性細胞浸潤在動物模型動脈瘤發生中起重要作用，尤其是在動脈瘤形成早期階段。MMP-2和MMP-9在動脈壁也有表達，通過控制膠原酶活性可降解血管壁細胞外基質成分，如彈力蛋白和膠原蛋白Ⅳ［12］。綜合考慮以上研究結果，MMP可能是由炎性細胞釋放，MMP-2和MMP-9在動脈瘤進展中發揮重要作用。

本實驗雖然對所有模型均通過彈力纖維損傷模擬動脈壁退化，但僅在5/9模型中出現新生動脈瘤。我們認為CCA分叉角度是重要影響因素，T形分叉角度（146.80°±40.84°）比Y形分叉角度（87.25°± 18.87°）更易發生動脈瘤。分叉角度與高速的血流速度和分散的渦流強度緊密相關，角度越大，分叉頂部周圍渦流強度越大，層流紊亂，從而產生各種機械刺激如WSS和WSSG［13］。本實驗對CCA分叉部WSS和WSSG定量分析證明，較大動脈瘤形成前分叉頂部周圍WSS和WSSG較高。WSS或WSSG增高可損傷正常血管內皮功能，激發基因轉錄，激活離子通道，從而導致細胞骨架重組［3，14］。6個月后與大量結構重塑同時出現的還有MMP-2和MMP-9增加。這些因素均與動脈瘤形成相關［15］。

然而，本實驗建立的CCA Y形分叉模型還不能完全模擬真正的顱內動脈瘤模型，因為該模型動脈全層均有損傷，這取決于彈力蛋白酶給藥方式與真正顱內動脈瘤形成機制存有差別，而真正的顱內動脈瘤形成是內膜損傷在前。此外，顱內動脈與顱外動脈相比具有特定解剖和生理特點，如內膜層厚，內彈力層發達而中膜和外膜較薄，僅有少量彈力纖維，甚至沒有外彈力膜，平滑肌細胞比例較大，其中最重要的是顱內動脈所處腦脊液環境，而本實驗模型無法完全模擬之。

總之，本實驗建立的較為接近人類動脈的犬CCA Y形分叉模型模擬了人體分叉部構筑，通過彈力蛋白酶誘發IEL及中膜彈力纖維損傷導致的血管壁退化，并在分叉部頂端模擬流速增加的血流動力學行為，在低WSS/WSSG和高壓力作用下成功誘發動脈瘤形成。該模型有助于研究動脈瘤發生發展過程的病理生理機制，可用于進一步研究動脈瘤相關基因、蛋白或生理通道等對動脈瘤發生發展和破裂的作用。

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