活化T細胞核因子調控基因在鈣調磷酸酶抑制劑藥效學監(jiān)測中的研究進展

2015-04-02 22:30:21袁梅閆美玲張弋天津醫(yī)科大學第一中心臨床學院天津300070天津市第一中心醫(yī)院天津3009

實用器官移植電子雜志 2015年3期

袁梅，閆美玲，張弋（.天津醫(yī)科大學第一中心臨床學院，天津 300070；.天津市第一中心醫(yī)院，天津 3009）

鈣調磷酸酶抑制劑（CNI）包括環(huán)孢素A（CsA）、他克莫司（FK506），廣泛應用于器官移植，超過80%的肝移植、腎移植患者使用CNI作為移植術后的免疫抑制劑［1］。臨床應用結果表明，CNI具有療效好、急性排斥反應發(fā)生率低的特點［2］。然而，CNI治療窗十分狹窄，臨床使用經驗劑量很可能會導致感染、癌癥、心血管疾病或由免疫抑制劑劑量過低引起的排斥反應的發(fā)生。此外，臨床使用CsA可能會出現腎毒性、多毛癥、牙齦增生、高血壓等不良反應；使用FK506可能會出現高血糖和神經毒性。大部分不良反應的發(fā)生都和藥物劑量有直接的關系［3-6］。然而血藥濃度水平低于靶濃度時，患者發(fā)生急性排斥反應的風險就會顯著升高。因此，使用CNI類藥物時必須進行常規(guī)的治療藥物監(jiān)測（TDM），才能避免發(fā)生不良反應。但是，TDM并不能很好地預測CNI對人體免疫細胞的作用，因為它不能反映出CNI對患者免疫系統(tǒng)的個體化抑制作用［7］。不同的患者在相同的血藥濃度下，其體內的免疫抑制程度可能會有很大的差異，這是由于不同患者的個體差異造成的對CNI藥效反應的不同［8］。因此，我們除了對使用CNI的患者進行血藥濃度監(jiān)測外，還需要監(jiān)測患者體內的免疫抑制情況［9-11］，從而對CNI進行藥效學監(jiān)測。最新研究表明，定量分析人體外周血中活化T細胞核因子（NFAT）調控基因：白細胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）和粒細胞巨噬細胞刺激因子（GM-CSF）的mRNA表達的均值可以用于CNI的藥效學監(jiān)測［12-13］。

1 CNI對人體的作用方式與藥效學監(jiān)測方法

CsA和FK506作用于T淋巴細胞，其主要作用就是抑制鈣調磷酸酶的活性。鈣調磷酸酶是激活T淋巴細胞產生細胞免疫所必須的條件，而且它是CsA親環(huán)蛋白和FK506結合蛋白復合物的結合目標。抑制鈣調磷酸酶的活性可以直接下調NFAT的脫磷酸作用，并隨后阻止轉錄因子NFAT進入細胞核脫磷酸化，從而抑制其調控基因IL-2、IFN-γ、GM-CSF的mRNA表達，與此同時，一些免疫系統(tǒng)的轉錄因子，例如IL-2或IFN-γ的轉錄過程被抑制［14-16］。

目前，已經存在一些分析方法可以用于評價CNI的藥效學作用，并且試驗結果表明這些藥效學參數可以用于免疫抑制劑的藥效學監(jiān)測［9，11，13］。這些評價指標包括檢測鈣調磷酸酶活性，從而監(jiān)測CNI對人體的免疫抑制情況；檢測人體細胞因子的表達情況或T淋巴細胞增殖情況，從而反映CNI對人體免疫細胞的抑制程度。然而，這些評價指標的檢測，例如人體細胞因子的合成情況、活性生物標志物的表達情況、T淋巴細胞的增殖情況或者鈣調磷酸酶的活性在臨床實際的應用意義尚未明確［11，17-18］。Giese 等［19］使用定量分析基因表達的方法來計算CNI的作用效果，特別是檢測對NFAT調控基因在外周血中轉錄活性的抑制情況。這種實驗方法是基于定量分析IL-2、IFN-γ和粒細胞、巨噬細胞、集落刺激因子在全血樣本中基因表達的均值，血樣的收集時間是CsA/FK506低谷時間（T0）和口服藥物兩小時后（T2）。臨床研究表明，定量分析NFAT調控基因（IL-2、IFN-γ、GM-CSF）mRNA表達均值的方法可以用于移植術后病情穩(wěn)定患者的CNI的特定藥效學監(jiān)測，是一種個體化CNI方案的有效工具［19］。

2 以NFAT調控基因的表達水平評價CNI藥效學

藥效學監(jiān)測方法只有結果準確可靠并易于檢測才能應用于臨床的藥效學監(jiān)測中。如今，定量檢測基因表達水平的方法已經應用于日常檢測中。這種分析方法可以提供準確可靠的檢測結果而且檢測方法方便快捷，現已廣泛應用于醫(yī)學診斷中，甚至已應用于藥效學監(jiān)測的相關性研究實驗中，并已確定了一些藥效學相關性參數。實時熒光PCR檢測方法是一種定量分析基因mRNA表達水平的快捷、高重現性并且高靈敏度的技術［20］。這種基因表達水平的檢測方法必須使用組織、外周全血或外周單核細胞（PBMCs）來進行定量分析［21］。

由于CNI通過抑制NFAT轉錄因子的表達來發(fā)揮藥效，在初次研究中使用熒光定量PCR方法檢測人體分離的PBMCs來確定其基因表達的水平［19］。然而，由于分離出來的PBMCs在體外時其對藥物的釋放度會產生一定程度的變化。而檢測服用CsA后人體內的全血樣本就可以確定有效的治療藥物劑量［21］。因此，在隨后的臨床研究中我們直接使用全血樣本來進行檢測，不再需要分離人體PBMCs。

一項對健康受試者體內血細胞的NFAT調控基因表達水平檢測結果表明，當CsA在全血中的濃度達到 100 ～ 500 μg/L 時，人體內的 IL-2、TNF-γ的mRNA表達受到抑制［19］。這項研究結果表明，人體內CsA血藥濃度在谷濃度和峰濃度時均對體內IL-2、TNF-γ的mRNA表達有抑制作用。與此同時，對全血中FK506的濃度測定與NFAT調控基因表達水平的測定結果也證實了這一結論。在一次使用全血樣本來進行NFAT調控基因表達水平監(jiān)測的初步研究中，進行腎移植和心臟移植的患者術后使用CNI后，其體內的NFAT調控基因的表達水平與健康對照組相比，其表達值平均減少3倍之多。在大多數發(fā)表的臨床研究中，NFAT調控基因的表達與患者個體化使用CNI的劑量密切相關［19，22-23］。而在一項對腎移植患者的長期穩(wěn)定的研究中，腎移植患者體內NFAT調控基因的表達水平具有很高的個體化差異，從2%～50%不等［24］。這些數據表明，腎移植患者術后體內的免疫抑制劑對免疫系統(tǒng)的作用程度具有相當大的個體化差異，應該對患者體內的免疫功能進行個體化的監(jiān)測。因此，我們建議對腎移植術后患者進行常規(guī)CNI藥物動力學監(jiān)測的同時，也要進行NFAT調控基因表達水平的監(jiān)測。

3 NFAT調控基因的表達在CsA中的臨床應用

眾所周知，藥效學監(jiān)測方法只有證實其對臨床應用有益處，這種藥效學監(jiān)測方法才可行。盡管文獻中報道了多種應用于CNI藥效學監(jiān)測的方法，但目前尚未有一種方法在臨床實踐中實現。而一些臨床研究結果證實了NFAT調控基因表達水平的測定可以作為有效的CNI個體化用藥的藥效學監(jiān)測方法。

在一項前瞻性臨床觀察研究中，對腎移植術后5年以上的穩(wěn)定期腎移植患者進行NFAT調控基因表達水平測定的結果表明，應用CsA的患者如果其體內NFAT調控基因即IL-2、IFN-γ、GM-CSF的mRNA表達值的總體平均值偏低，則患者發(fā)生反復感染與腫瘤病變的可能性則顯著提高，且患者發(fā)生非黑瘤皮膚癌的風險也會顯著提升［25］。在一項對照研究中，逐漸減少患者的CsA劑量，患者體內NFAT調控基因的總體表達的平均值不斷升高，但并沒有發(fā)生任何不良反應。只有一位患者在其CsA劑量不斷減少且體內NFAT調控基因的總體表達平均值升高了40%以后，該患者發(fā)生了急性細胞排斥反應，并且隨著逐漸減少CsA劑量，患者的收縮壓和平均動脈壓均有所下降，從而患者發(fā)生心血管疾病的風險有所下降［22］。因此，對于腎移植術后情況長期穩(wěn)定的患者，其體內的NFAT調控基因的總體表達平均值維持在20%～30%最佳［26-27］。如果患者體內的NFAT調控基因的總體表達平均值低于15%，則患者發(fā)生感染的風險顯著升高（57.4%比14.7%，P＜0.001）。邏輯回歸分析的結果證實，NFAT調控基因的表達值是發(fā)生反復感染的獨立影響因素之一。患者體內NFAT調控基因的總體表達平均值低于15%時，會增加患者發(fā)生非黑瘤皮膚癌的風險，同時也增加發(fā)生CsA不良反應的風險。NFAT調控基因的總體表達平均值維持在15%～30%時，大部分腎移植患者的移植腎功能都是正常且穩(wěn)定的［28］。總而言之，在對長期穩(wěn)定的腎移植術后患者的前瞻性臨床試驗研究中證實，監(jiān)測NFAT調控基因的表達值可以作為腎移植術后長期穩(wěn)定的患者減少CsA劑量的一項重要的依據。

在最新的一項臨床研究［29］中，研究者對18例肝移植術后使用CsA作為免疫抑制劑的兒童患者進行了體內NFAT調控基因表達水平的測定。結果表明，NFAT調控基因的表達水平與CsA-C2血藥濃度具有良好的相關性（r2＝0.647，P＜0.002）。同時，研究者還發(fā)現，在這18例兒童中有6例兒童發(fā)生了感染，而這6例兒童體內的NFAT調控基因表達水平較未發(fā)生感染反應的兒童顯著偏低（27%比50%，P＝0.041）。

Steinebrunner等［30］在一項對肝移植術后發(fā)生巨細胞病毒（CMV）感染的患者與術后情況穩(wěn)定的患者體內NFAT調控基因的總體表達水平的研究中發(fā)現，10例術后使用CsA作為免疫抑制劑且發(fā)生了CMV感染的患者與20例術后使用CsA作為免疫抑制劑且情況穩(wěn)定的患者相比，其體內NFAT調控基因的總體表達水平偏低（30±17比44±20，P＝0.067），體內IFN-γ的表達值則顯著偏低（26±17比43±17，P＝0.0125）。而兩組患者服用的CsA劑量和C0、C2的血藥濃度并無顯著差異（CsA 劑量 169 mg/d比 165 mg/d，C0 CsA 94 μg/L比 85 μg/L，C2 CsA 389 μg/L 比 381 μg/L；P ＞ 0.05）。而Steinebrunner等［31］在另一項對肝移植患者術后早期的前瞻性試驗研究中發(fā)現，13例術后應用CsA作為免疫抑制劑的肝移植患者，其體內的NFAT調控基因的總體表達水平在術后顯著提高，4～7個月與術后1個月時相比為（25±7） μg/L比（9±5） μg/L（P ≤ 0.000 1）。

迄今，這些試驗研究對患者體內NFAT調控基因表達水平的測定都開始于腎移植術后早期。正如預測的那樣，對這些腎移植術后早期患者的觀察表明，對于大部分腎移植患者而言，高劑量CsA對患者體內NFAT調控基因的表達有顯著的抑制作用［32］。相應的，如果減少CsA劑量，其體內的NFAT調控基因的表達水平會明顯上升。然而，相比較正常患者而言，腎移植術后早期發(fā)生感染的患者，其體內的NFAT調控基因表達水平顯著偏低。如果減少CsA劑量，則相應減少了對人體NFAT調控基因的表達抑制，但一部分患者則會出現急性排斥反應。然而，我們應該注意到，還有少部分腎移植患者，其體內NFAT調控基因的表達水平是相同的，但患者卻分別出現了急性排斥反應和感染兩種截然相反的不良反應。總而言之，目前臨床上報道的關于腎移植術后早期CNI藥效學的試驗數據還很少，并且由于腎移植術后早期臨床給予患者高劑量的CNI，使得評價患者體內CNI藥效學與NFAT調控基因表達水平之間的關系還是有一定的困難。

4 NFAT調控基因的表達在FK506中的臨床應用

目前，最實用的且對臨床有實際應用價值的FK506藥效學監(jiān)測方法就是檢測NFAT調控基因IL-2、IFN-γ、GM-CSF的mRNA表達水平，這種檢測方法的實際意義已經在對穩(wěn)定期的腎移植患者進行藥效學監(jiān)測中得到證實［33］。患者口服FK506 1.5小時后，其體內NFAT調控基因表達水平的最小中位數相差很大，從0%到138%不等。在對262例腎移植術后穩(wěn)定期患者的研究中發(fā)現，超過半數患者體內NFAT調控基因表達水平低于30%，而有25例患者體內NFAT調控基因表達水平高于80%。發(fā)生急性排斥反應的患者與正常患者相比，在FK506谷濃度相同的條件下，發(fā)生急性排斥反應的患者體內NFAT調控基因表達水平明顯偏高。有25%的患者在體內NFAT調控基因表達水平高于30%時都發(fā)生了急性排斥反應。然而有20例患者，在其體內NFAT調控基因沒有表達或受到少量抑制時，并無任何排斥反應出現。

與上述研究相似的研究試驗結果表明，在發(fā)生感染的穩(wěn)定期腎移植患者中，其體內NFAT調控基因表達水平的中位數是12%，與正常患者的32%相比，顯著降低。其中7例患者出現了惡性腫瘤：3例患者體內NFAT調控基因表達水平低于30%，而其他4例患者體內NFAT調控基因表達水平超過30%［34］。此外，體內NFAT調控基因表達水平抑制程度低的患者與抑制程度高的患者相比，具有更好的移植腎功能。多元回歸分析結果表明，患者體內NFAT調控基因表達水平的中位數是急性排斥反應的一個獨立影響因素；而感染則與患者的性別和體內NFAT調控基因表達水平密切相關。

在一項較小的前瞻性試驗研究中，感染CMV的患者服用FK506 1.5小時后其體內NFAT調控基因表達水平較未感染CMV的患者顯著下降（13%比26%，P＜0.05）［34］。邏輯回歸分析的結果表明，服用FK506 1.5小時后患者體內NFAT調控基因表達水平與感染CMV的風險密切相關。

一項對由使用CsA轉換為使用FK506的移植患者的初步研究結果表明，患者使用FK506后體內NFAT調控基因表達水平會比服用CsA增高7倍之多［33］。對27例由于臨床情況的原因由CsA轉服FK506的患者的研究結果顯示，患者服用CsA時體內NFAT調控基因表達水平的中位數是3.0%，而轉服FK506后，患者體內NFAT調控基因表達水平的中位數是 36.5%［35-36］。Fukudo等［37］的研究結果表明，患者服用FK506后當血藥濃度達峰值時其值高于20 μg/L，而患者服用CsA后其血藥濃度超過700 μg/L時，患者體內鈣調磷酸酶的活性被完全抑制［38］。

在一項對肝移植術后發(fā)生CMV感染的患者與術后情況穩(wěn)定的患者體內NFAT調控基因總體表達水平的研究中，Steinebrunner等［30］發(fā)現，10例術后使用FK506作為免疫抑制劑且發(fā)生了巨細胞病毒感染的患者與20例術后使用FK506作為免疫抑制劑且情況穩(wěn)定的患者相比，其體內NFAT調控基因的總體表達水平偏低（68±25比84±22，P＝0.076 9），IFN-γ表達值也顯著偏低（61±24比88±29，P＝0.015 4）。而兩組患者服用的FK506劑量和C1.5的血藥濃度則并無顯著差異（FK506劑量4 mg/d 比 4 mg/d ；FK506 C1.5 8 μg/L 比 10 μg/L）。而Steinebrunner等［31］在另一項對肝移植患者術后早期的前瞻性試驗研究中發(fā)現，9例術后應用FK506作為免疫抑制劑的肝移植患者，其體內的NFAT調控基因的總體表達水平在術后8～12個月與術后1個月時相比顯著升高〔（50±8） μg/L比（10±7） μg/L，P ＝ 0.002）〕。

Sommerer等［39］對262例腎移植術后服用FK506且處于長期穩(wěn)定的患者進行了臨床試驗研究，結果表明，發(fā)生排斥反應的患者體內NFAT調控基因表達水平顯著高于未發(fā)生排斥反應者（57%比21%，P＜0.001）；且發(fā)生急性排斥反應患者體內的FK506血藥濃度顯著低于未發(fā)生排斥反應者（10 μg/L比18 μg/L，P＜0.001）。發(fā)生感染的患者體內NFAT調控基因表達水平顯著低于未發(fā)生感染者（12%比32%，P＜0.001）；且發(fā)生感染的患者體內FK506血藥濃度顯著高于未發(fā)生感染反應者（22 μg/L比16 μg/L，P ＜ 0.001）。

5 小結

一些橫斷面研究和臨床觀察性試驗研究的結果表明，測定NFAT調控基因（IL-2、IFN-γ、GM-CSF）的mRNA表達水平，可以作為一種個體化檢測CsA和FK506免疫抑制劑的工具。定量分析NFAT調控基因mRNA表達水平可以為檢測實體器官移植患者體內靶細胞水平的免疫抑制功能提供一種可靠的量化指標［40］。尤其是對監(jiān)測患者的不良反應，如感染、惡性腫瘤或排斥反應都有很大的益處。目前已經建立了標準化測定方法，可以使NFAT調控基因表達水平的檢測應用于臨床常規(guī)檢測中。使用NFAT調控基因表達水平的測定可以在一天內檢測出患者體內對CNI的藥效學反應。將這種檢測方法與常規(guī)的血藥濃度檢測相結合，可以個體化患者的CNI劑量。到目前為止，大量臨床試驗表明，移植術后早期患者體內NFAT調控基因mRNA表達水平與發(fā)生急性排斥反應之間存在著明確的相關性［41］。然而，有一些重要的問題尚未明確，例如患者在發(fā)生急性感染或慢性感染時是如何影響體內NFAT調控基因mRNA表達水平的。目前看來，檢測NFAT調控基因mRNA表達水平是一種方便快捷且十分可靠的CNI藥效學檢測工具。

然而，這種檢測技術本身也有一些局限性。首先，就這種檢測方法目前的使用情況來看，它只能作為一種特定的CNI藥效學監(jiān)測工具。其次，患者在發(fā)生急性感染或慢性感染時影響體內NFAT調控基因mRNA表達水平的機制也尚未明確，且就目前的臨床試驗研究來看，研究對象都是移植術后長期穩(wěn)定的患者，具有一定的局限性。再次，這種試驗方法尚未在更大、更系統(tǒng)的試驗研究或是前瞻性隨機臨床試驗研究中得以證實。