肝移植術(shù)后移植物抗宿主病診治進(jìn)展

楊靖波（天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津市器官移植重點實驗室，天津 300192）

肝移植術(shù)后移植物抗宿主病（graft-versushost disease，GVHD）比較罕見，發(fā)生率約為0.1%～2.0%，病死率大于75%。累及肝外多個系統(tǒng)，可侵犯包括周身皮膚、消化道黏膜、神經(jīng)系統(tǒng)、骨髓等，臨床表現(xiàn)不典型，多出現(xiàn)發(fā)熱、皮疹、腹瀉、癲癇、骨髓造血停滯等表現(xiàn)，但缺乏明確診斷的客觀依據(jù)。

早在50多年前Billingham［1］就提出GVHD是供體T細(xì)胞與受體組織間的免疫反應(yīng)。其發(fā)生需要以下條件：① 移植物中含免疫活性細(xì)胞；② 受體表達(dá)與供體不同的組織抗原；③ 受體對移植物的細(xì)胞缺乏免疫反應(yīng)。

1 GVHD的發(fā)生機(jī)制

GVHD的發(fā)生相當(dāng)復(fù)雜，危險因素包括人類白細(xì)胞抗原（HLA）匹配度、供受者年齡、患者免疫狀態(tài)、移植前輸血、再次肝移植、多器官聯(lián)合移植等。其發(fā)生尤其與主要組織相容性抗原（majorhistocompatibilityantigen，MHA）的相合程度密切相關(guān)。可能的機(jī)制包括：① 相容性抗原的差異；② 供者免疫活性T淋巴細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）；③ 細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)。

1.1 相容性抗原的差異：供受體間組織相容性抗原的差異是GVHD的始發(fā)因素。供者T淋巴細(xì)胞識別宿主不同的主要組織相容性復(fù)合物（MHC）抗原而增殖分化，并對含有該MHC抗原的某些受體組織或器官進(jìn)行免疫攻擊，發(fā)生GVHD。在HLA相合的移植中，次要組織相容性抗原的差異在GVHD的發(fā)生中起了重要作用［2］。

1.2 供者免疫活性T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞：供者T細(xì)胞是GVHD發(fā)生的關(guān)鍵因素［3］。同種反應(yīng)性細(xì)胞毒T細(xì)胞與分泌細(xì)胞因子的輔助T細(xì)胞可通過細(xì)胞毒反應(yīng)和（或）釋放淋巴因子參與GVHD的發(fā)生。Th1與Th2相互制約，機(jī)體通過調(diào)節(jié)Th1/Th2比例，維持細(xì)胞免疫和體液免疫的平衡。另外，有人發(fā)現(xiàn),患者在移植前如果體內(nèi)NK細(xì)胞活性正常或增高時，移植后則易發(fā)生GVHD。

1.3 細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)：GVHD被認(rèn)為與Th1和Th2亞群所分泌的細(xì)胞因子失去平衡有關(guān)。目前大多數(shù)國外研究認(rèn)為，腫瘤壞死因子-α（TNF-α），白細(xì)胞介素-1（IL-1）、IL-2及IL-6等在GVHD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其他細(xì)胞因子如IL-12、γ-干擾素（IFN-γ）、IL-18，Th2細(xì)胞因子如IL-4、IL-10、IL-13等也與GVHD的發(fā)生密切相關(guān)［4］。

肝移植術(shù)后GVHD根據(jù)不同的發(fā)病原因可分為兩類：一類是血型ABO不相容所致的GVHD體液反應(yīng)，其發(fā)生機(jī)制是供肝攜帶的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗宿主紅細(xì)胞抗體，導(dǎo)致受體發(fā)生溶血性貧血。這類過程常發(fā)生在移植手術(shù)后1～2周。這類疾病大多具有自愈性，個別嚴(yán)重貧血的患者可行輸血治療。另一類即文獻(xiàn)中及臨床上常描述的，供體T細(xì)胞所導(dǎo)致的細(xì)胞免疫性GVHD，其發(fā)生機(jī)制是供肝內(nèi)的T細(xì)胞識別宿主MHC或次要組織相容性抗原而激活，隨后發(fā)生克隆性分化和擴(kuò)增。致敏T細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子，形成細(xì)胞因子風(fēng)暴（cytokinestorm），并進(jìn)一步激活自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）及抗宿主細(xì)胞的毒性T 淋巴細(xì)胞（cytolytic T lymphocyte，CTL），進(jìn)而導(dǎo)致一系列的正反饋連鎖反應(yīng)，最終作用于受者皮膚、消化道及骨髓等器官，引起嚴(yán)重的臨床癥狀［5-6］。

近年來，Socié等［7］提出將GVHD發(fā)生的病理過程分為5個步驟：① 預(yù)處理導(dǎo)致組織損傷釋放促炎性細(xì)胞因子，激活抗原呈遞細(xì)胞及供者T細(xì)胞增殖；② 共刺激信號激活異源反應(yīng)性T細(xì)胞；③異源反應(yīng)性T細(xì)胞擴(kuò)增與分化；④ 活化的異源反應(yīng)性T細(xì)胞遷移到GVHD靶組織；⑤ 效應(yīng)性T細(xì)胞破壞靶組織。

2 GVHD的診斷

Triulzi等［6-8］將肝移植術(shù)后GVHD的診斷標(biāo)準(zhǔn)歸納為以下三點：① 靶器官受累引起的特征性臨床癥狀和體征，如皮膚、消化道、骨髓等；② 受累及的器官組織學(xué)檢查；③ 受累及的器官或外周血中供體淋巴細(xì)胞存在的人類白細(xì)胞抗原（HLA）或DNA證據(jù)。到目前為止，肝移植術(shù)后GVHD的確診仍是個挑戰(zhàn)。受體外周血中出現(xiàn)供體細(xì)胞數(shù)量大于受者外周血有核細(xì)胞數(shù)量的1%時，再加上皮疹、發(fā)熱、腹瀉、全血細(xì)胞減少等臨床表現(xiàn)，即高度提示肝移植術(shù)后GVHD。綜合分析各種因素在疾病過程中的作用，將有助于提出新的特異性診斷指標(biāo)，正確判斷病情發(fā)展，及早采取有效的預(yù)防措施，也有助于指導(dǎo)臨床GVHD的治療，完善治療方案。

2.1 以下是肝移植術(shù)后GVHD常見臨床表現(xiàn)

2.1.1 GVHD相關(guān)皮膚、黏膜損傷：GVHD和中毒性表皮壞死松解癥（TEN）均是肝移植術(shù)后少見而嚴(yán)重的并發(fā)癥。嚴(yán)重的急性GVHD和TEN因臨床表現(xiàn)相似，鑒別診斷比較困難，兩者病理機(jī)制仍不明確。目前認(rèn)為肝移植術(shù)后GVHD患者出現(xiàn)腹瀉是由于細(xì)胞毒T細(xì)胞攻擊胃腸道黏膜所致，免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)受者循環(huán)系統(tǒng)中存在淋巴細(xì)胞嵌合現(xiàn)象對診斷有重要作用［9］。皮膚活檢可用于早期排查，如活檢發(fā)現(xiàn)表皮基底層呈空泡樣改變，苔蘚樣淋巴細(xì)胞浸潤、角化不良、嗜酸粒細(xì)胞壞死等組織學(xué)特征，則高度提示GVHD，但特異性較差。若胃、十二指腸或結(jié)腸黏膜活檢提示黏膜細(xì)胞凋亡并發(fā)現(xiàn)供者淋巴細(xì)胞浸潤高度提示為GVHD。Jeanmonod等［10］報道1例肝移植術(shù)后病情急性進(jìn)展的患者，肝移植術(shù)后10日，患者無明顯誘因出現(xiàn)發(fā)熱、皮疹、腹瀉、骨髓造血停滯等，皮膚活檢提示TEN，內(nèi)鏡見食道、胃黏膜多處糜爛，活檢示非特異性炎癥反應(yīng)，免疫組化結(jié)果嵌合達(dá)40%以上，結(jié)合臨床提示GVHD。激素沖擊并廣譜抗菌藥物預(yù)防感染，皮疹消褪。患者最終因免疫功能低下合并嚴(yán)重感染，發(fā)病2周后死于感染性多器官功能衰竭。

1961年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，抗菌藥物治療異基因骨髓移植的嵌合體小鼠，可以明顯降低小鼠的死亡率。一項在allo-BMT小鼠中所進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，飼料中給予小鼠難吸收的抗菌藥物，使小鼠成為無菌小鼠，可明顯降低移植小鼠的死亡率。在無菌受鼠中，未發(fā)現(xiàn)任何移植小鼠死于GVHD，而在無抗菌藥物飼養(yǎng)的對照組中，95%的小鼠移植后100天死于GVHD［11］。在一項以狗為對象的研究中也獲得了類似的結(jié)果。在接受allo-BMT的實驗狗中給予難吸收抗菌藥物進(jìn)行選擇性腸道滅菌治療，主要排除胃腸道中的需氧菌，而保留厭氧菌。由于腸道內(nèi)源性菌群（主要為厭氧菌群）的存在，有效地抑制了外源性微生物在狗腸道中的繁殖，明顯地降低了GVHD的發(fā)病率和發(fā)病程度［12］。

2.1.2 神經(jīng)系統(tǒng)損害：越來越多的證據(jù)表明，GVHD也是移植術(shù)后發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的危險因素。有報道顯示，在GVHD模型鼠的腦組織中見到淋巴細(xì)胞浸潤現(xiàn)象［13-14］。Hartrampf等［15］研究發(fā)現(xiàn)，在異基因造血干細(xì)胞移植GVHD鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中檢測到供者來源的活化T淋巴細(xì)胞浸潤，以及受者神經(jīng)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞死亡現(xiàn)象，研究中同時發(fā)現(xiàn)GVHD受者學(xué)習(xí)、記憶能力下降，焦慮行為表現(xiàn)增加。

2.1.3 骨髓造血停滯：GVHD能抑制骨髓造血，造成白細(xì)胞及血小板減少，甚至發(fā)生貧血、再生障礙性貧血。免疫組化分析可發(fā)現(xiàn)供受體嵌合現(xiàn)象，然而發(fā)生機(jī)制尚不明確。在GVHD發(fā)生早期，骨髓活檢常提示一系血細(xì)胞（常首先為粒細(xì)胞系）減少，骨髓表現(xiàn)為輕微抑制。后期骨髓象示骨髓嚴(yán)重發(fā)育不良，各系血細(xì)胞減少，嚴(yán)重再生障礙性貧血表現(xiàn)。一旦出現(xiàn)這種情況，很難糾正，患者最終常因膿毒癥或全身多器官功能衰竭而死亡。

2.2 關(guān)于嵌合的檢測：1992年Starzl等［16］提出，肝、腎器官移植后長期生存的受者，其嵌合體不僅存在于移植器官，而且存在于全身。移植肝臟中約1×l09個細(xì)胞源于供者白細(xì)胞，包括單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞，進(jìn)入受者體內(nèi)，目前已在受者多個器官，包括血液、淋巴結(jié)、皮膚、腸中發(fā)現(xiàn)，在長期存活的器官移植受者體內(nèi)建立了穩(wěn)定的嵌合狀態(tài)。微嵌合體為受者全部有核細(xì)胞含供者細(xì)胞＜1%，微嵌合體理論認(rèn)為供-受者微嵌合體是耐受的前提。系統(tǒng)性嵌合體（即受者全部有核細(xì)胞含供者細(xì)胞＞1%）在確定GVHD的受者中較普遍［17］。關(guān)于微嵌合體能否促進(jìn)異體移植耐受性還存在爭議。認(rèn)為不能促進(jìn)異體移植耐受的觀點主要有：① 微嵌合體在器官移植耐受者中不普遍存在；② 微嵌合體是偶發(fā)現(xiàn)象，不能誘導(dǎo)耐受性。關(guān)于嵌合體的檢測方法，目前常用的是聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），示例如下。

2.2.1 多聚合酶鏈反應(yīng)-短串聯(lián)重復(fù)序列（PCRSTR）：是一類高度多態(tài)性的遺傳標(biāo)志，由2～7個堿基對組成的核心序列經(jīng)過幾次到十幾次重復(fù)，構(gòu)成長度100～400 bp的特定DNA片段，又被稱為“微衛(wèi)星DNA”，是基因嵌合檢測中非常敏感和特異的檢測方法［18-21］，被大多數(shù)醫(yī)院接受。PCR-STR可以快速檢測受體內(nèi)外周血中供體DNA，且不受供受體間HLA匹配影響，檢測嵌合體時具有多態(tài)性高、結(jié)果穩(wěn)定可靠等特點，其檢測靈敏度可達(dá)1%。研究發(fā)現(xiàn)，肝移植術(shù)后出現(xiàn)GVHD特異性臨床癥狀，且皮疹區(qū)組織活檢行PCR-STR檢測提示20%以上的供體CD3+T淋巴細(xì)胞，就可確診GVHD。

2.2.2 PCR-SSP ：Taylor等［22］采用 PCR-SSP HLA分型篩選33例臨床上懷疑為GVHD的患者，檢查他們是否有供體細(xì)胞嵌合體的證據(jù)；其中7例患者檢測到供體DNA，并經(jīng)過流式細(xì)胞儀進(jìn)行了確認(rèn)。這7例患者中有5例在出現(xiàn)GVHD癥狀時行PCR。SSP檢測到他們體內(nèi)供體CD3+細(xì)胞的水平為20%～50%；另外2例患者在行肝移植4周后進(jìn)行檢測，結(jié)果分別為4%和8%。最終高嵌合表達(dá)的5例患者都死于肝移植后GVHD，另外2例也最終確診為GVHD。Uchiyama等［23］借助HLA匹配度更高的活體肝移植分析HLA匹配是否對受體預(yù)后產(chǎn)生影響，以及HLA匹配與GVHD的關(guān)系。結(jié)果顯示，HLA高匹配度不僅影響移植物遠(yuǎn)期預(yù)后，同時也是致命性GVHD的危險因素。

2.2.3 細(xì)胞因子檢測：GVHD是由供者T細(xì)胞介導(dǎo)、通過細(xì)胞毒作用和分泌炎癥細(xì)胞因子等機(jī)制導(dǎo)致組織損傷，可侵犯皮膚、胃腸道、肝臟、肺部等多種器官和組織［24］。很多研究機(jī)構(gòu)開始將重點放在CD4+T細(xì)胞亞群及其效應(yīng)因子免疫調(diào)控方面。其中包括Th17、IL-17、Th22、IL-22、Tr1及IL-10、IL-1、IL-18、IL-17A、趨化因子等。有研究提出Toll樣受體也與GVHD有一定關(guān)系，他可能通過誘導(dǎo)抗原呈遞、調(diào)控炎癥細(xì)胞因子分泌或直接影響Th細(xì)胞功能等途徑，影響GVHD的發(fā)生發(fā)展。

GVHD重在預(yù)防，首先是供體的選擇，盡量避免使用HLA位點相近的供體；其次供肝處理過程中，盡量耗竭供體中的T細(xì)胞；然后對HLA配型相近或年齡較大的受者，術(shù)后應(yīng)用比較溫和的免疫抑制方案，但這也可能增加受體發(fā)生排斥反應(yīng)的風(fēng)險。目前GVHD確診尚存在困難，治療更是爭論不斷，包括免疫抑制劑的調(diào)整、激素的應(yīng)用，甚至炎性細(xì)胞因子拮抗劑的應(yīng)用均存在爭議［25］。現(xiàn)在臨床預(yù)防及治療GVHD，主要是通過使用免疫抑制劑以及去除移植物中的T淋巴細(xì)胞，也有報道是通過利用免疫細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，干預(yù)細(xì)胞因子達(dá)到預(yù)防與治療GVHD的目的，但因為GVHD發(fā)生機(jī)制尚不明確，且免疫系統(tǒng)呈網(wǎng)絡(luò)式表達(dá)與相互制約，GVHD免疫調(diào)節(jié)方面的預(yù)防與治療仍處在初期階段。曾有研究報道使用CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞預(yù)防GVHD，提高臨床HIA半相合造血干細(xì)胞移植（HSCT）的成功率［26-28］，Bacchetta等［29］將體外誘導(dǎo)得到的同種異體抗原特異性Trl細(xì)胞作為HSCT的輔助治療手段。該方法是在體外將供者T淋巴細(xì)胞與受者外周血單個核細(xì)胞（PBMC）與IL-10共培養(yǎng)，然后將誘導(dǎo)分化得到的T淋巴細(xì)胞輸注到接受HLA半相合的HSCT患者體內(nèi)。應(yīng)用該方法誘導(dǎo)分化得到的T細(xì)胞中除了有大量同種異體抗原特異性Trl細(xì)胞，還包含了初始以及記憶性T細(xì)胞，所以與單純接受移植治療的患者比較，急性GVHD的程度較輕，而且未發(fā)生慢性GVHD。有研究發(fā)現(xiàn)，人的間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSC）在體外具有免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用［30］。Le Blanc等［31］的實驗結(jié)果表明，BMMSC對混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用。胡文兵等［32］實驗發(fā)現(xiàn)，BMMSC在體內(nèi)對不同的T細(xì)胞亞群表現(xiàn)出不同的調(diào)節(jié)作用。BMMSC聯(lián)合移植組與單純異基因骨髓移植組比較，CD4+細(xì)胞數(shù)量明顯減少，CD8+細(xì)胞數(shù)量明顯增多，說明BMMSC在體內(nèi)能夠減少CD4+細(xì)胞數(shù)量，同時增加CD8+細(xì)胞數(shù)量。

GVHD發(fā)生機(jī)制尚不明確，診斷困難，治療往往延誤，GVHD患者最終常因膿毒癥等死亡，故應(yīng)常規(guī)監(jiān)測，盡早給予敏感抗菌藥物及有針對性的支持治療是有必要的。關(guān)于細(xì)胞因子在GVHD中的作用，目前的研究尚缺乏系統(tǒng)性，其潛在有效性尚需大量實驗予以進(jìn)一步證實與探索。