多色熒光原位雜交檢測尿沉渣診斷膀胱尿路上皮癌的可行性分析

楊濤　李燕　李巖　劉俊江　孫福振　王剛

作者單位: 050051石家莊市，河北省人民醫院泌尿外科(楊濤、劉俊江、孫福振、王剛)，血液內科(李燕)，體檢中心(李巖)

多色熒光原位雜交檢測尿沉渣診斷膀胱尿路上皮癌的可行性分析

楊濤李燕李巖劉俊江孫福振王剛

作者單位: 050051石家莊市，河北省人民醫院泌尿外科(楊濤、劉俊江、孫福振、王剛)，血液內科(李燕)，體檢中心(李巖)

【摘要】目的研究分析多色熒光原位雜交檢測尿沉渣診斷膀胱尿路上皮癌的可行性。方法選取膀胱尿路上皮癌患者30例，納入對照組。選取30例正常人，納入觀察組。2組均進行熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridiza-tion，FISH)檢測尿沉渣，統計并分析染色體畸變情況。結果觀察組與對照組3、7、17、9p21染色體畸變數差異有統計學意義(P<0.05)。3探針敏感性為36.67%，7探針敏感性為43.33%，17探針敏感性為40%，9p16探針敏感性為50%，4組合用探針敏感性為70%顯著高于單獨使用，差異有統計學意義(P<0.05)。結論多色熒光原位雜交檢測尿沉渣診斷膀胱尿路上皮癌診斷療效顯著，值得臨床廣泛推廣及應用。

【關鍵詞】多色熒光原位雜交檢測;膀胱尿路上皮癌;診斷

E-mail: tommy325523@163.com

熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)在醫學臨床上廣泛應用，其中以乳腺癌HER-2基因檢測最為廣泛指導其臨床治療。目前在實際的使用熒光原位雜交技術的過程中，也開始使用一種全新的方式，即使用本文中提到的多色熒光原位雜交技術，這種技術能夠更好的顯示出在實際的檢測過程中的多種顏色，并能夠減輕在實際的對惡性腫瘤在檢測的過程中出現的諸如顯示不清以及觀察無法達到相關要求的情況，對于患者而言有著極為重要的意義。本研究將FISH運用于膀胱尿路上皮癌檢測尿沉渣來進行診斷，體現3、7、17、9p21染色體畸變在診斷檢測膀胱尿路上皮癌的臨床價值。報告如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選取我院2011年8月至2013年8月收治的膀胱尿路上皮癌患者30例為對照組。男18例，女12例;年齡37～68歲，平均年齡(52±6)歲;所有患者均確診為膀胱尿路上皮癌。觀察組30例，男16例，女14例;年齡39～70歲，平均年齡(54±6)歲。2組患者年齡、性別比等一般資料比較差異無統計學意義(P＞0.05)具可比性。

1.2方法

1.2.1對2組均采取膀胱尿路上皮癌進行檢測。取2組患者晨尿200 ml檢測。

1.2.2多色熒光原位雜交檢測。首先注意對特異性探針進行相應的處理。探針由北京金菩嘉公司贊助的膀胱癌診斷試劑盒，在這種試劑盒中，主要是含有CSP3/CSP7以及GLP17/GSP17兩組一套的雙色探針設備，在這種探針使用的的過程中，探針往往能夠定位3p11.1～q11.1以及7p11.1～q11.1，同時在對應的熒光信號方面，能夠對應紅色以及綠色的熒光信號。對于GPL p16/CSP 17的探針組，能夠定位9p21以及17p11.1～q11.1，同時對于于GPL p16/CSP 17的探針組，在對應的熒光信號方面能夠對應紅色以及綠色的信號。在對特異性的探針在選擇完成以及進行相關的處理完成后，需要注意對于主要的相關使用溶液進行配置。本研究中的緩沖液的配置，使用88 g氯化鈉44 g檸檬酸鈉以及400 ml的去離子水進行配置，在實際的配置過程中，將所有的物質進行充分的溶解，要在常溫下進行pH值的調節，使用鹽酸將pH值調整在5.3左右，同時使用離子水進行定容，容量為500 ml同時注意在2～8℃的環境下進行儲存，也需要注意保質期，一般在配置完成后6個月后需要丟棄，在此過程

情況，立即將試劑室溫下將10 mol/L值調整在7.0左液進行定容，定容至的環境下進行相應需要注意對其進行了渾濁或是污染等溶液的配置方面，需要注意選擇70%以及85%的乙醇，在實際的乙醇溶液的配置過程中，注意將700 ml以及850 ml的無水乙醇，通過使用去離子水對于無水乙醇進行稀釋，分別將無水乙醇稀釋到1l，同時需要注意在無水乙醇的使用過程中，將乙醇放置在2～8℃的環境下進行儲存以及使用，在配置完成后的1個月后或使用20張的玻片進行雜交完成后立即丟棄，試劑在此過程中，出現實際的污染或渾濁的情況，立即丟棄。玻片處理:用RNase (Sigma，0.1 g/L)和Pepsin(Sigma，0.1 g/L)先后處理，10 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS緩沖液洗滌后，玻片在700 ml/L甲酰胺/2×SSC(pH值7.0)，72℃變性3 min，2×SSC 4℃3 min洗滌2次，梯度乙醇脫水，室溫晾干。探針處理:按照探針2 μl、ssDNA 2 μl (或Cot-1 DNA 2 μl)、H2O 46 μl、3 mol/L NaAc 5 μl、100%乙醇(－20℃) 110μl配成沉淀體系，置－80℃30 min，12 000 r/min離心10 min，去上清加75%乙醇洗滌，再離心去上清，避光自然晾干，加著絲粒(或BAC)探針雜交液8μl，室溫避光溶解30min以上，75℃水浴變性7 min，37℃水浴預復性30min。雜交:將探針加到玻片的標本上，覆蓋玻片，Rubber Cement封片后置濕盒37℃溫箱中避光雜交48 h。洗片:除去蓋玻片，將玻片放入500ml/L甲酰胺/2×SSC溶液，42℃洗滌15 min，2×SSC室溫搖洗3 min×2次，梯度乙醇脫水，室溫暗處晾干，加20 μl二氨基苯基吲哚(DAPI，Vysis公司)復染，封片。

1.3信號檢測在熒光顯微鏡下觀察圖像，單體標準:單個信號的核比例＞15%。三體及以上標準:三個及以上信號的核＞10%細胞總數。組合探針標準:至少4個細胞中有兩個染色體擴增同時存在3、7、17中或至少在12個細胞中存在9p21純合性缺失。

1.4統計學分析應用SPSS 19.0統計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，計數資料采用χ2比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.12組患者3、7、17、9p21四種探針診斷結果比較觀察組與對照組比較，差異有統計學意義(P＜ 0.05)。見表1，圖1、2。

表1　2組患者3、7、17、9p21四種探針檢測結果比較n=30，±s

表1　2組患者3、7、17、9p21四種探針檢測結果比較n=30，±s

組別37917觀察組8.56±1.86　8.13±1.47　4.19±1.89　7.11±1.98對照組　14.33±4.96　11.23±4.22　10.36±4.61　11.56±5.33 t值5.9660　3.7996　6.7577　4.2867 P值0.0000　0.0003　0.0000　0.0001

圖2　17號染色體(綠色熒光)顯示異常增多核型

圖1　17號染色體(綠色熒光)異常增多核型; 9p21(紅色熒光)為單倍體，異常缺失

2.23、7、17、9p21四種探針診斷膀胱尿路上皮癌情況4種組合使用療效較單獨使用差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2　3、7、17、9p21及四種聯合診斷膀胱尿路上皮癌情況n=30，例(%)

3　討論

膀胱尿路上皮癌在泌尿系統較為多見的腫瘤［1］，也是一種常見的泌尿系統惡性腫瘤。在我國的一項登記檢查中發現，膀胱癌的發病幾率已經達到了6.61/10萬，約為惡性腫瘤發病的第9位。膀胱癌可發于任何年齡，甚至有兒童也會出現膀胱癌的相關癥狀，其發病率會隨著年齡的增長而增加，高發年齡在50～70歲，同時男性膀胱癌的發病率約為女性膀胱癌發病率的4倍左右。在1998年，國際泌尿病理學會以及國際衛生組織(WHO)建議使用尿路上皮一詞代替移行細胞一詞，通過這種方式能夠較好的對患者辯別鼻腔以及卵巢內部的移行上皮，并通過這種方式，能夠使得尿路上皮成為了一種尿路系統的專有名詞。在2004年，國際衛生組織又發布了《泌尿系統及男性生殖器官腫瘤病理學和遺傳學》。通過這種形式，能夠將患者尿路系統腫瘤組織學分類過程中的膀胱癌的病理類型，其中包括膀胱尿路上皮癌、膀胱腺癌、膀胱鱗狀細胞癌，同時還有膀胱透明細胞癌以及膀胱小細胞癌和膀胱類癌等，其中最為常見的就是膀胱尿路上皮癌，目前約占所有膀胱癌患者總數的90%左右，通常所說的膀胱癌大部分就指的是膀胱尿路上皮癌，在以往被稱為膀胱移行細胞癌。臨床上采取膀胱鏡檢查及尿細胞學，膀胱鏡檢查屬有創性檢查對患者影響較大［2～3］。尿細胞雖屬無創但靈敏度較差。目前多色熒光原位雜交檢測在臨床上得到認可，能填補上述檢測缺陷，具備特異性強能直接在染色體上定量標記及定性、屬無創檢查、敏感度較高，操作簡單、穩定、重復性好等優點［4］。據研究顯示，多色熒光原位雜交檢測診斷膀胱尿路上皮癌特異性為86%～97%，敏感度為59%～86%［5］。尿路上皮癌患者9p21均缺失，是早期診斷的重要標志，3號染色體畸變達76%，17號畸變達51%，7號畸變達38%［6］。本研究我院30例患者采取FISH診斷敏感性高達80%，與研究相符。采用FISH檢測患者與正常人比較，差異有統計學意義(P<0.05)。在FISH檢測中發現，4種探針組合使用70%顯著高于3、7、9、17單獨探針，差異有統計學意義(P<0.05)。

對于多色熒光原位雜交檢測技術而言，是一種目前較為常用的物理圖譜繪制的相關方法，在實際的繪制過程中，需要使用熒光素對探針進行相應的標記，并在標記完成后需要檢測探針以及分裂中期染色體或是在分裂間期的染色體雜交的情況［7］。這種方法主要是上個世紀80年代在放射性原位雜交技術的基礎上開發出的一種非放射性分子細胞的相關遺傳技術，通過使用熒光標記的方式，能夠較好的對同位素標記進行相應的代替，并在代替后能夠成為一種全新的原位雜交方法。在實際的使用過程中，首先能夠和某一種介導分子進行結合，在結合完成后能夠通過雜交等形式再通過免疫細胞化學的相關過程中，和熒光染料進行連接。在此過程中，主要是需要使用DNA探針對于特殊的核苷酸分子進行相應的標記，在標記完成后可以使用探針直接的雜交到染色體或是DNA的纖維切片上，并需要使用熒光素分子偶聯的單克隆抗體和探針分子的特異性結合，通過這種形式能夠較好的檢測出DNA相關的序列在DNA的纖維切片或是在染色體上的定位以及相對的定量分析［8］。在實際的使用熒光原位雜交的過沉重，在實際的檢測過程中往往具有快速、安全、靈敏以及能夠顯示多種顏色等特點，不僅是在顯示的過程中能夠對于顯示中期的分裂相進行相應的顯示，同時也能夠顯示出間期核［9］。目前在實際的使用熒光原位雜交技術的過程中，也開始使用一種全新的方式，即使用本文中提到的多色熒光原位雜交技術，這種技術能夠更好的顯示出在實際的檢測過程中的多種顏色，并能夠減輕在實際的對惡性腫瘤在檢測的過程中出現的諸如顯示不清以及觀察無法達到相關要求的情況，對于患者而言有著極為重要的意義［10］。尤其是對膀胱尿路上皮癌患者而言，在臨床進行檢測的過程中，往往會由于其特點無法使用CT MRI或X線平片技術對患者的病灶進行相應的觀察因此對于膀胱尿路上皮癌患者在檢測的過程中通過使用多色熒光原位雜交技術技術，能夠及時有效的對膀胱尿路上皮癌患者進行檢測，對于患者的技術有效治療以及制定治療方案而言有著極為重要的意義，同時在實際的對膀胱尿路上皮癌在檢測過程中也會具有安全、快速、靈敏度高、探針能長期保存、能同時顯示多種顏色等優點，在臨床上也值得推廣應用［11］。

本研究發現觀察組與對照組3、7、17、9p21染色體畸變數差異有統計學意義(P<0.05)。3探針敏感性為36.67%，7探針敏感性為43.33%，17探針敏感性為40%，9p16探針敏感性為50%，4組合用探針敏感性為70%顯著高于單獨使用，差異有統計學意義(P 0.05)，這種情況說明在臨床對膀胱尿路上皮癌患者在進行檢測的過程中，使用多色熒光原位雜交檢測技術是切實有效的，能夠在臨床對膀胱尿路上皮癌患者進行及時有效的診斷［12］。同時在此過程中，需要注意進行閾值的建立。在實際的閾值建立的過程中，需要對于正常人的尿液進行FISH的檢驗，同時也需要注意每一個探針組合需要對于100各信號較為清晰的細胞，同時在此過程中，需要注意對于2號、7號以及1號的染色體進行閾值的建立，在實際的建立過程中，需要注意建立起3個或3個以上的閾值。而對于PL6而言，需要建立起2個閾值，并需要愛此過程中將異常信號細胞數字的百分比進行相應的統計，使用相關的閾值計算公式對于閾值進行相應的計算。同時對于形態異常的脫落細胞進行分析的過程中，需要注意，每一組的探針組合應該對至少25個細胞進行相應的分析，若在此過程中無法較好的對于結果進行相應的確定，可以在實際的對于異常脫落細胞進行分析的過程中，可以對于分析細胞的數量進行增加，同時在此過程中，細胞的增加數量并沒有上限。在對FISH進行測定的過程中，需要注意兩個指標陽性就能夠確定FISH為陽性。同時對于一個指標出現了復雜異常的情況，若出現了一個指標出現了復雜異常的情況則表示每一種的異常信號模式細胞的數量高于4。

綜上所述，多色熒光原位雜交檢測尿沉渣診斷膀胱尿路上皮癌診斷療效顯著，具備特異性強能直接在染色體上定量標記及定性、屬無創檢查、敏感度較高操作簡單、穩定、重復性好值得臨床廣泛推廣及應用。

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(收稿日期:2014－12－20

通訊作者:劉俊江，050051河北省人民醫院泌尿外科;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.09.011

【文章編號】1002－7386(2015) 09－1319－04

【文獻標識碼】A

【中圖分類號】R 694