血漿EBV-DNA在中晚期鼻咽癌患者中表達水平差異性

李中文 湯明 鄒彥

大量文獻證實EBV與鼻咽癌的發生密切相關。且同時表明血漿EBV-DNA水平和鼻咽的腫瘤負荷、預后、腫瘤治療后復發轉移等情況密切相關[1-2]。同時，有文獻報道血漿EBV-DNA水平在早期和中晚期鼻咽癌患者中存在差異性[3-4]。由于鼻咽癌發生部位隱蔽，癥狀不明顯，因此中晚期患者居多，作為鼻咽癌診斷和預后敏感性和特異性均較高的血漿EBV-DNA水平是否在初診中晚期鼻咽癌中存在較大差異，缺少相關資料。本研究采用熒光定量聚合酶鏈反應技來分析60例中晚期初診鼻咽癌患者血漿EBV-DNA水平在中晚期不同分期的變化情況，進一步證實血漿EBV-DNA水平在不同分期中晚期鼻咽癌診斷中的價值，為以后通過分析血漿EBV-DNA水平來早期判斷患者預后，以及為進一步中晚期鼻咽的治療包括誘導化療、放療、同期化療等方案的選擇提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2009年12月-2013年5月，遵義醫學院附屬腫瘤醫院收治的Ⅲ、Ⅳa、Ⅳb+Ⅳc期鼻咽癌患者。納入標準：鼻咽組織活檢病理證實為鼻咽非角化型或者角化型鱗狀細胞癌，且根據UICC第7版2010分期的Ⅲ、Ⅳa、Ⅳb、Ⅳc期鼻咽癌患者。

1.2 方法 標本采集采集血液標本時間為鼻咽組織活檢病理證實為鼻咽非角化型或者角化型鱗狀細胞癌后1周內，放化療開始前。熒光定量PCR引物及探針的設計血液標本離心分離血漿，熒光定量PCR原理，參考文獻[5-6]。本院實驗室德國羅氏公司產定量PCR系統，型號：Light Cycle。PCR反應試劑盒來自中山醫科大學下屬達安基因診斷中心。上下游引物序列分別為 W-44F（5’-TCTATGACTACAGGCAA-3’）和 W-119R（5’-AGACGGCCTGTCCAACGT-3’）。在PCR反應體系中加入雙標記的熒光探針，探針序列 為：5’（FAM）CACTATATCTACAGTCCAGCCTCC（TAMRA）-3’。擴增的目的基因是EBV的BamH1-W相關片段。

1.3 反應體系 抽取外周血2 mL，3000 rpm，離心2 min，取白細胞層及血漿1000 μL，13 000 rpm，離心5 min，收集沉淀，純水洗滌3次。上清液2 μL，8000 rpm 8 s。PCR 循環條件：（1）93 ℃ 2 min；（2）93 ℃45 s→ 55 ℃ 60 s→ 10 循環；（3）93 ℃ 30 s→ 55 ℃45 s→30循環。

1.4 血漿游離EBV-DNA含量的計算 計算公式為C=Q×（VDNA/VPCR）×（1/Vext），其中C為血漿DNA拷貝數值（copies/mL），Q為經PCR擴增后計算機檢測的原始拷貝數值，VPCR是用于PCR擴增的DNA的體積，VDNA為提取的DNA稀釋液體積。

1.5 統計學處理 使用SPSS 18.0統計分析軟件包進行結果分析，EBV-DNA拷貝數及年齡經正態性檢驗后，不滿足正態分布者用中位數及四分位間距表示，組間差異采用秩和檢驗，有差異者進一步進行兩兩比較；滿足正態分布者用（±s）表示，組間差異比較采用方差分析；組間性別比比較采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象一般情況 共納入患者60例，其中男54例，年齡28~75歲，中位年齡53.6歲；女6例，年齡31~68歲，中位年齡48.5歲。分期患者年齡、性別結構比較差異無統計學意義。見表1。本研究納入的鼻咽癌患者EBV-DNA檢出率為100%。

表1 各分期患者年齡與性別組成情況比較

2.2 患者血漿EBV-DNA定量PCR檢測結果比較 患者血漿EBV-DNA定量PCR檢測結果，比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 不同分期鼻咽癌患者EBV-DNA拷貝數比較 ×103 copies/mL

3 討論

鼻咽癌雖然世界許多國家均有發生，但是大部分地區發病率較低。有明顯的區域性和種族聚集性，亞洲人多見，其中以中國的南方如廣東、廣西、湖南等地區最高。自OLD發現EBV（Epstein-Barr virus，EBV）與鼻咽癌在血清上有一定的關系以來，鼻咽癌患者EBV及其抗體的研究層出不窮。鼻咽癌的相關抗體主要是IgA、IgG、IgM，不能客觀、及時、準確的反映病毒的感染情況和復制情況。即使患者腫瘤完全消失，達到治愈標準，其體內的相關抗體消失也有明顯的滯后性，甚至部分患者持續存在[7]。

鼻咽癌病理表現非角化型或者角化型鱗狀細胞癌占90%以上。隨著研究的深入，發現EBV-DNA是一個可靠、靈敏的指標[8-11]。EBV和鼻咽癌的關系密切，基本上所有的非角化型或者角化型癌都能檢測到EBV-DNA。對于外周血漿的EBV-DNA的檢測方法有很多。其中主要的方法聚合酶鏈反應（PCR）的相關方法，包括PCR的定性、半定量和定量。特別是定量在靈敏度、特異度和準確性方面都有很高的價值，也是目前檢測血漿EBV-DNA最常用的方法。各種外周血漿EBV-DNA的PCR定量檢測不是檢測病毒的完整顆粒，而是對病毒DNA相關片段的檢測。大量研究發現，EBV的EBNA-1、EBNA-2、Bam HI-w結構區域、BXLF-1基因片段是常用的檢測目標片段，可以得到相似的陽性結果[12-14]。同時，不同基因片段間也存在一定的差異性。這其中BamHI-w結構區域的研究最多，檢測這一片段可以大大的提高檢測的特異度和靈敏度，是臨床上最常用的目的基因片段。其本身為EBV的一段高度保守、高度重復的堿基序列。個體感染的EBV病毒株的亞型不完全一樣，堿基重復的次數也存在差異，一般在10~13次間。

有研究者應用RT-PCR方法對80例鼻咽癌患者和80例感染過EBV的健康人群比較鼻咽癌患者外周血漿EBV-DNA陽性率達到90%，而80名感染過EBV的健康對照者外周血漿中并未檢出相關病毒。這重要發現表明EBV-DNA來自于感染EBV的腫瘤細胞的凋亡，而不是在血中復制的結果。統計分析發現原發部位腫瘤細胞的凋亡值和血漿EBV-DNA呈現獨立的正相關性（P<0.05）[5]。也有人對100例鼻咽癌患者的外周血漿和原發部位的EBV的基因差異性進行比較和PCR擴增后的產物進行測序，結果證實完全吻合。這一發現同樣也證實外周血EBV-DNA及其片段來自于原發部位腫瘤的凋亡[15]。大多數研究者認為，EBV-DNA不是病毒感染后在外周血中的自我復制和分離，而是腫瘤生長部位的瘤細胞含有病毒顆粒，瘤細胞凋亡后病毒顆粒及其片段被釋放入血[5，13-16]。這一結論對于EBV-DNA在鼻咽癌診斷、分期、預后預測等的價值有著重要作用。因此，普遍認為外周血漿EBV-DNA的水平與原發部位含有EBV的腫瘤細胞凋亡數有正相關性。同時，在細胞凋亡的過程中，細胞本身的脫氧核苷酸酶使病毒顆粒斷裂為80~190 bp間的小片段；而與宏觀的腫瘤侵犯周圍的血管床沒有明顯相關性。但是就EBV-DNA進入外周血中的具體機制問題，目前還存在很多疑點。對于病毒在外周血中的代謝機制及其轉歸情況，目前沒有這方面的資料研究。所以，有學者推測其釋放入血機制很可能與細胞凋亡水解密切相關。對于鼻咽癌腫瘤細胞凋亡的相關研究，將有助于病毒代謝的研究。當然對于外周血中EBV-DNA的研究，也有助于原發腫瘤的診斷、復發的判斷等。

總之，外周血漿中EBV-DNA對于鼻咽癌的敏感性和特異性均較高[7-8]。熒光定量PCR技術不僅具有PCR的高靈敏度特點，同時還具有準確、快速、不容易被污染的特點[4]。為研究血漿EBV-DNA水平提供了可靠、安全、穩定的方法。相關文獻資料表明血漿EBV-DNA水平相對穩定，敏感性和特異性均較高。本組的EBV-DNA敏感性為100%。并且大量文獻證實EBV-DNA水平和鼻咽的腫瘤負荷，臨床分期，預后，腫瘤治療后復發轉移情況密切相關。EBV-DNA復制量隨著腫瘤負荷的增加，病情的加重而逐漸增加。但是在不同分期中，特別是中晚期鼻咽癌患者血漿EBV-DNA水平是否有差異，未見相關文獻報道。

本文應用熒光定量PCR技術對60例鼻咽癌初治患者在治療前血漿EBV-DNA水平進行定量檢測。數據表明治療前Ⅲ、Ⅳa、Ⅳb+Ⅳc期，EBV-DNA拷貝數中位數和范圍存在著明顯差異性。這一結果證實患者EBV-DNA水平在中晚期不同分期鼻咽癌患者外周血漿中存在明顯差異。從EBV-DNA水平的角度印證了血漿EBV-DNA在鼻咽癌診斷、分期中的價值和地位以及與各期預后情況相一致，以及和腫瘤負荷的相關關系。關于本組60例初治中晚期鼻咽癌患者，其血漿EBV-DNA均陽性，陽性率達到100%，這可能和樣本量不大有關。當然，也和相關報道，中晚期鼻咽癌患者外周血血漿EBV-DNA陽性率在90%以上相符合。

需要指出的是，因為目的擴增片段、PCR循環數、實驗試劑、探針的大小、具體堿基序列等因素有很大的關系，各個實驗室的數據之間有一定的差異性，但是就單一一個實驗室而言，自身具有客觀的可比性。但各研究機構應用不同的實驗設計理念、PCR的試劑和實驗方法、儀器設備等不同，實驗結果數據之間存在一定的差異[17]。這樣不利于數據之間的比較，分析等。其影響因素主要有兩個方面：（1）存在于外周血漿的游離EBV-DNA的片段大小多在80~190 bp之間。所以，擴增PCR的目的片段也在190 bp以內。但是擴增片段的具體大小存在一定的差異。其結果也會有一定的差異。（2）定量PCR過程中PCR循環次數、引物和探針的片段序列及大小，目的基因的堿基序列等設計不同，對應的檢出率和檢測結果必定存在一定的差異性[14]。因此，有學者呼吁建立統一的實時定量PCR標準品和統一實驗室條件，并制定出國際、國內通用的標準，以便各個實驗室的檢測結果有可比性和統一性。最終使血漿EBV-DNA成為一個廣泛應用的血液學相關指標的。這對于現在實驗數據的比較，以后實驗方法的改進，都有很大的益處。

總之，中晚期鼻咽癌患者不同分期外周血血漿EBV-DNA水平存在明顯差異性，這一結論對于將外周血血漿EBV-DNA作為鼻咽癌早期診斷、分期和預后判斷都有一定價值，對于是否不同分期鼻咽癌患者外周血漿EBV-DNA水平是否有恒定的數值范圍，還需要實驗相關條件的統一和大樣本的研究證實。

[1]李宇紅，邵建永，馮惠霞，等.鼻咽癌患者血漿游離EBV-DNA的定量檢測及其臨床意義[J].中國腫瘤臨床，2004，31（8）：421-424.

[2]王雪英.定量檢測血漿EBV-DNA在鼻咽癌診治中的臨床研究[J].當代醫學，2012，18（12）：5-6.

[3]楊德輝，柳青.鼻咽癌患者血漿游離EBV-DNA檢測的研究現狀[J].中山大學研究生學刊，2006，26（1）：112-115.

[4] Leung， Benny Z， Brigete B M， et al.Plasma Epstein-Barr viral deoxyribonucleic acid quantitaqution complements tumor-nodemetastasis staging prognostication in nasopharyngeal carcinoma[J].J Clin Oncol，2006，24（34）：5414-5418.

[5] Mutirangura A， Printhanakasem W， Theamboonlers A， et al.Epstein-Barr viral DNA in serum of patients with nasopharyngeal carcinoma[J].Clin Cancer Res，1998，4（3）：665-669.

[6] Heid C A， Stevens J， Livak K J， et al.Real time quantitative PCR [J].Genome Res，1996，6（28）：986-994.

[7]范國宇，劉偉.血漿EBV-DNA 與VCA-IgA聯合檢測對鼻咽癌診斷的意義[J].中國實用醫藥，2012，7（19）：46-47.

[8] Lo Y M， Chan A T， Chan L Y， et al.Moleculor prognostication of nasopharyngeal carcinoma by quantitative analysis of circulation Epstein-Barr virus DNA[J].Cancer Res，2000，60（24）：6878-6881.

[9]黃爽，管西寅，應紅梅.血漿EB病毒DNA檢測在鼻咽癌中的應用進展[J].中國癌癥雜志，2012，22（3）：227-231.

[10] Baizig N M， Morand P， Seigneurin J M， et al.Complementary determination of Epstein-Barr virus DNA load and serum markers for nasopharyngeal carcinoma screening and early detection in individuals at risk in Tunisia[J].Eur Arch Oto-Rhinol，2012，269（3）：1005-1011.

[11]馬美，杜曉東.PET-CT聯合EBV-DNA在預測鼻咽癌復發中的研究[J].中國耳鼻咽喉頭頸外科，2013，20（1）：21-23.

[12]吳少雄，趙充，崔念基，等.誘導化療在局部晚期鼻咽癌放射治療中的價值[J].腫瘤防治雜志，2004，11（12）：1289-1292.

[13] Shotelersuk C， Khorpraset C， Sakdikul S， et al.Epstein-Barr virus DNA in serum/plasma as a tumor marker for nasopharyngeal carcinoma [J].Clin Cancer Res，2000，82（6）：1046-1051.

[14] Lo Y M， Chan L Y.Quantitative and temporal correlation between circulation cell free Epstein-Barr virus DNA and tumor recurrence in nasopharyngeal carcinoma[J].Cancer Res，1999，59（21）：5452-5455.

[15] Lin J C， Wang W Y， Chen K Y， et al.Quantification of plasma Epstein-Barr virus DNA in patients with advanced nasopharyngeal carcinoma[J].N Engl J Med，2004，350（24）：2461-2470.

[16]王巍巍，黃大毛，王雷，等.血漿EB病毒DNA數量與鼻咽癌細胞凋亡的相關性分析[J].實用癌癥雜志，2011，26（1）：4-6.

[17] Hayden R T， Hokanson K M， Pounds S B， et al.Multicenter comparison of different real-time PCR assays for quantitative detection of Epstein-Barr virus[J].Clin Microbiol，2008，46（1）：157-163.