甘草提取物對人表皮黑素細胞遷移及細胞內鈣離子的影響

黎 雯，牛 牧，黃瑞葉

(海南省皮膚病醫院皮膚外科，海南 海口 570206)

甘草提取物對人表皮黑素細胞遷移及細胞內鈣離子的影響

黎 雯，牛 牧，黃瑞葉

(海南省皮膚病醫院皮膚外科，海南 海口 570206)

目的 探討甘草提取物對體外培養人表皮黑素細胞遷移和細胞內游離鈣離子濃度的影響。方法從健康人包皮組織分離、培養黑素細胞，用甘草提取物處理黑素細胞，對照組僅加入等量培養基，采用Transwell微孔膜法研究黑素細胞遷移，采用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測鈣離子。結果當甘草提取物在濃度＞1.25 mg/L時，其黑素細胞遷移數目與對照組比較差異具有統計學意義(P＜0.05)；實驗濃度下的甘草提取物經處理后均能降低人黑素細胞內鈣離子的水平；不同濃度甘草提取物對黑素細胞細胞內鈣離子的影響與對照組比較，差異均有統計學意義(P＜0.05）。結論推測甘草提取物可能通過降低黑素細胞內游離鈣離子的濃度從而抑制進黑素細胞的遷移。

黑素細胞；甘草提取物；遷移；鈣離子

甘草是中醫治療中較為常用的藥物，祖國醫學認為甘草具有補脾益氣、祛痰止咳、清熱解毒、緩急止痛、調和諸藥的功效。西方醫學研究發現甘草具有抗炎、抗氧化、抗變態反應和美白的作用[1]。甘草的化學成分較為復雜，現在已從甘草中分離出的較多化合物，但其中主要成分為甘草甜素、甘草次酸。近年來有研究提示甘草有抑制黑素細胞酪氨酸酶和黑素瘤細胞黑素合成的作用[2]。為深入研究甘草對人表皮黑素細胞的調控作用，筆者首先體外分離、培養正常人表皮黑素細胞，然后采用不同濃度的甘草提取物處理黑素細胞，觀察黑素細胞增殖情況，通過檢測細胞內鈣離子濃度的變化，以探討甘草提取物對其可能的作用機制，為化妝品及藥物的研發提供更多的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品 甘草提取物采購自中國藥品生物制品所。先用二甲基亞砜(DMSO)溶解，配制成濃度100 g/L母液，置于-20℃冰箱低溫保存，實驗過程中用新鮮培養基調至終濃度。

1.2 主要試劑的配制 M254培養基、人黑素細胞生長添加劑HMGS購自美國Cascade公司；MTS購自美國Promega公司；青霉素-鏈霉素雙抗、0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；DMSO購于美國Sigma公司；Dispase分離酶購自美國羅氏試劑公司；

1.3 細胞來源 健康人表皮黑素細胞，來源于6～18歲青少年男性包皮環切術后的包皮組織，由海南省皮膚病醫院皮膚外科門診手術室提供。患者已知情同意。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組 分別設定甘草提取物濃度為1.25 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、20.0 mg/L，對照組僅加入等量培養基，其甘草提取物濃度為0。

1.4.2 分離人表皮黑素細胞 首先將包皮組織放在75%的酒精中浸泡約10 min，拿出后用磷酸鹽緩沖液(PBS)液沖洗5～8次；使用眼科剪剔除脂肪組織，再用PBS液沖洗5～6次；將組織剪為1.5 mm×1.5 mm的組織塊，置于培養皿中；加入Dispase酶5 ml，置于4℃冰箱中16 h，后移入培養箱孵育1 h；然后剪去真皮，留下表皮。再使用PBS沖洗組織2～3次，常溫下0.25%胰蛋白酶消化5 min，最后加入FBS終止。玻璃管吹打組織，制成人表皮黑素細胞懸液，后用200目細胞篩過濾，低速離心(1 200 r/min)3 min后細胞計數。調整細胞濃度為5×104/ml，接種于無菌培養瓶中，每瓶加入M254完全培養基4 ml，隨后置于37℃的二氧化碳恒溫培養箱中培養。48 h后可給予首次換液，以后每隔2～3 d換液1次，方法同文獻[3]。

1.4.3 人表皮黑素細胞的鑒定(L-DOPA染色法) 取第三代人表皮黑素細胞，消化后調整黑素細胞濃度至1×104/ml，接種在6孔培養板中，置于培養箱中培養48 h。后加入已預熱至37℃的4%多聚甲醛固定細胞25 min，雙蒸水沖洗3次。將細胞蓋玻片轉移至L-DOPA染色液中浸泡，每隔30 min觀察染色情況，約3 h后染液呈棕色，漂洗蓋玻片，復染細胞核，梯度酒精逐級脫水，最后二甲苯透明及中性樹膠封片。

1.4.4 不同濃度甘草提取物對人表皮黑素細胞遷移的影響 選取孔洞直徑為8.0 μm的聚碳酸酯膜Transwell小室。把纖連蛋白(FN)用培養基稀釋至20 μg/ml，室溫下Transwell小室底面包被。黑素細胞消化后重懸于含0.1%FBS的M254培養基中，調整細胞濃度至1×105/ml。然后在每個Transwell上室加入100 μl；下室內分別加入濃度為1.25 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、20.0 mg/L的甘草提取物完全培養液500 μl，另設對照組，僅添加完全培養基。每孔均設3個復孔，置于培養箱中培養24 h。隨后取出Transwell小室，用棉簽拭去上層小室的細胞，甲醛將下室面的黑色細胞固定25 min，將聚碳酸酯膜用刀片切下，用蘇木精染色10 min，每張膜在高倍鏡下隨機選取3個視野，觀察并計算移行的黑素細胞數量。實驗重復3次，方法參考文獻[4]。

1.4.5 人表皮黑素細胞內鈣離子測定 消化細胞后，調整細胞濃度至1×104/ml，接種于中央打孔的培養皿中，加入培養基500 μl，另設對照組，僅添加完全培養基。培養24 h后，分別給予1.25 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、20.0 mg/L甘草提取物完全培養基培養24 h，后用PBS沖洗，于37℃用10 μmol/L Fluo-3/AM負載30 min，PBS沖洗，置于激光共聚焦顯微鏡載物臺，Bio-Rad激光共聚焦軟件，動態掃描細胞內熒光強度改變(激發波長488 nm，發射波長526 nm)，實驗重復3次。

1.5 統計學方法 應用SPSS18.0統計軟件進行數據分析，計量數據以均數±標準差(±s)表示，計量資料的比較采用t檢驗，計數資料的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 人表皮黑素細胞鑒定結果 經左旋多巴染色后，鏡下可見人表皮黑素細胞樹突及胞漿呈黑色或棕褐色，此為陽性反應，證明為黑素細胞，見圖1。

圖1 L-DOPA染色陽性人表皮黑素細胞(×200）

2.2 甘草提取物對人表皮黑素細胞遷移的影響 甘草提取物在濃度為1.25 mg/L時黑素細胞遷移與對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，但當濃度為2.5 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、20.0 mg/L時黑素細胞遷移與對照組比較差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 甘草提取物對黑素細胞遷移的影響(±s)

表1 甘草提取物對黑素細胞遷移的影響(±s)

甘草提取物濃度(mg/L) 0(對照組) 1.25 2.5 5.0 10.0 15.0 20.0人表皮黑素細胞遷移數28.667±3.750 28.583±2.282 25.367±2.433 25.403±2.518 25.667±1.986 23.167±3.033 22.235±4.122 t值(與對照組比較) P值(與對照組比較) 0.057 4 2.164 2 2.214 7 2.167 8 2.120 9 3.421 1 0.954 9 0.043 6 0.041 6 0.045 6 0.049 9 0.003 5

2.3 甘草提取物對人表皮黑素細胞內鈣離子的影響 實驗濃度下甘草提取物處理后均能降低人黑素細胞內鈣離子的水平；不同濃度甘草提取物與對照組比較差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 不同濃度甘草提取物對體外培養黑素細胞細胞內鈣離子的影響

3 討論

黑素細胞起源于神經嵴，其分化發育歷經3個階段：自胚胎發育2～5周時期開始，在細胞表面受體家族整合素的作用下，神經嵴細胞不斷地發生遷移，在此過程中可轉化為成黑素細胞、黑素細胞并移行其適宜的生存環境-表皮基底層及毛囊。黃褐斑、雀斑以及日光性損傷等色素障礙性皮膚病由于黑素顆粒過多聚集引起。黑素細胞的遷移在其發病中其重要作用。細胞遷移對胚胎發育、傷口愈合、白細胞吞噬、惡性腫瘤細胞侵襲和轉移具有非常重要的意義[5]。甘草的化學組成較為復雜，目前為止從甘草中分離出的化合物有甘草甜素、甘草次酸、甘草甙、異甘草甙、新甘草甙等數十種化合物，但其中的主要成分為甘草甜素和甘草次酸。祖國醫學認為甘草具有補脾益氣、清熱解毒、止咳祛痰、調和諸藥的功效。西方醫學認為甘草還具有抗炎、殺菌和美白、抗氧化和清除自由基作用。有研究發現甘草有抑制黑素細胞酪氨酸酶和黑素瘤細胞黑素合成的作用。本研究用目前常用的Transwell微孔濾膜法檢測體外培養黑素細胞遷移，研究表明：甘草提取物在濃度為1.25 mg/L時黑素細胞遷移與對照組比較差異無統計學意義，但當濃度為2.5 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、20.0 mg/L時黑素細胞遷移與對照組比較差異均有統計學意義。但濃度繼續增大對于黑素細胞的影響，我們目前的實驗未涉及，我們將在今后的試驗中擴大甘草提取物濃度范圍，以全面、系統地分析其對黑素細胞調控作用。

在細胞中，鈣是重要的第二信使，通過其可調節細胞遷移活動[6]。本實驗通過激光共聚焦系統檢測細胞內[Ca2+]i濃度的變化，研究甘草提取物對黑素細胞遷移及細胞內鈣離子的影響。通過激光共聚焦顯微鏡，可觀察亞細胞水平上Ca2+、pH值、膜電位等生理信號及細胞形態的變化。研究結果提示：實驗濃度下甘草提取物處理后均能降低人黑素細胞內鈣離子的水平；不同濃度甘草提取物與對照組相比較差異均有統計學意義。顯示甘草提取物可促進細胞內鈣離子的降低，推測可能是甘草提取物某些成分可組織鈣離子與細胞胞膜受體結合后激活磷脂酶C(PLC)，進而減少PLC分解磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸生成二酯酰甘油(DAG)、肌醇-1，4，5三磷酸(IP3)的能力。減少IP3與受體結合，使細胞內儲存的Ca2+釋放減少。

本研究未發現較高濃度的甘草有細胞毒性作用。通過以上數據我們推測甘草提取物中某些成分可能通過誘導細胞內Ca2+降低從而抑制黑素細胞遷移，為化妝品及藥物的研發提供更多的理論依據。

[1]Fu Y,Chen J,Li YJ,et al.Antioxidant and anti-inflammatory activities of six flavonoids separated from licorice[J].Food Chem,2013, 141(2):1063-1071.

[2]Yokota T,Nishio H,Kubota Y,et al.The in hibitory effect of ab ridin from licorice extracts oll melanogenesis and inflammation[J]. Pigment Cell Res,1998,11(6):355-361.

[3]張迪敏,洪為松,傅麗芳,等.個體化培養自體黑素細胞移植治療白癜風[J].中華皮膚科雜志,2010,43(10):721-725.

[4]Abdul-Wahid A,Huang EH,Cydzik M,et al.The carcinoembryonic antigen IgV-like N domain plays a critical role in the implantation of metastatic tumor cells[J].Mol Oncol,2014,8(2):337-350.

[5]Aguino A,Formica V,Preto SP,et al.Drug-induced increase of carcinoembryonic antigen expression in cancer cells[J].Pharmacol Res,2004,49(5):383-396.

[6]Komuro H,Kumada T.Ca2+transients control CNS neuronal migration[J].Cell Calcium,2005,37(5):387-393.

Effects of licorice extract on migration and[Ca2+]i in human melanocytes in vitro.

LI Wen,NIU Mu,HUANG Rui-ye.
Department of Dermatologic Surgery,Hainan Provincial Center for Skin Disease and STI Control,Haikou 570206,Hainan,CHINA

ObjectiveTo observe the effects of licorice extract on migration and[Ca2+]i in human melanocytes in vitro．MethodsHuman melanocytes,obtained from normal foreskins,were treated with licorice(the study group)and equivalent medium(the control group).Cell migration was assessed using the transwell micropore filter method,and[Ca2+]i was detected by confocal laser scanning microscope.ResultsWhen the concentration of licorice extract was higher than 1.25 mg/L,the migration number of melanocyte was statistically significantly different from that of the control group(P＜0.05).After treatment with the experimental concentration of licorice extract,[Ca2+]i levels in the human melanocytes were significantly reduced.The effect of different concentrations of licorice extract on [Ca2+]i showed statistically significant difference with that of the control group(P＜0.05).ConclusionLicorice extract inhibite the melanocyte migration through reducing the concentration of[Ca2+]i.

Melanocyte;Licorice extract;Migration;[Ca2+]i

R284.2

A

1003—6350（2015）13—1876—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.13.0676

2015-01-21)

黎 雯。E-mail：lw1025325@163.com