Artemin蛋白在胃癌組織中的表達及其與胃癌臨床病理特征的關系

馬耀先

(許昌市中心醫院腫瘤科，河南 許昌 461000)

Artemin蛋白在胃癌組織中的表達及其與胃癌臨床病理特征的關系

馬耀先

(許昌市中心醫院腫瘤科，河南 許昌 461000)

目的 探討Artemin蛋白在胃癌組織中的表達及其與胃癌臨床病理特征的關系。方法采用免疫組化法對90例胃癌患者的癌組織及30例胃癌患者的癌旁良性組織中的Artemin蛋白進行檢測，統計學分析Artemin蛋白在胃癌組織中的表達，并探討推測Artemin蛋白與胃癌患者的臨床病理特征的關系。同時通過熒光定量RT-PCR法測定胃癌組織與癌旁組織中Artemin mRNA的表達差異。結果Artemin蛋白在胃癌組織中陽性表達率為78.89%，明顯高于癌旁良性組織的10.00%，差異具有統計學意義(P＜0.05)，且Artemin蛋白在胃癌組織中的表達與胃癌患者的腫瘤浸潤程度、淋巴結轉移及臨床TNM分期有密切關系(P＜0.05)，而與胃癌患者的性別、年齡、腫瘤大小及分化程度無關(P＞0.05)；Artemin mRNA在胃癌組織中的表達明顯高于癌旁組織7.01倍，推測Artemin參與了胃癌的發生或發展的過程。結論胃癌組織中的Artemin蛋白表達與腫瘤的侵襲轉移有密切關系，可作為有效的檢測指標來預測分析胃癌的發生、發展及侵襲過程，具體機制有待進一步研究。

胃癌；Artemin蛋白；免疫組化法；臨床病理特征

胃癌是我國十大常見惡性腫瘤之一，根據1973-1975年全國人口死因調查及1990-1992年1/10抽樣人口死因調查資料顯示[1]，胃癌的死亡率仍然居腫瘤死亡之首，占腫瘤中的死因構成23.24%。盡管在全球范圍內，胃癌發病率呈下降趨勢，但其病死率仍高居世界第2位[2]，僅次于肺癌，其發病率逐年升高，給社會家庭及個人帶來了嚴重的經濟損失和心理負擔，早期胃癌大多數患者無明顯癥狀，有少數人有惡心、嘔吐或類似于潰瘍病的上消化道癥狀，由于現代醫療技術還未能有效的通過相關指標及早發現臨床上胃癌的發生，往往會耽誤有效的治療時間而演變成胃癌晚期。

Artemin(ARTN)同GDNF、Neurturin(NTN)及Persephin(PSP)都是膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)的家族配體(GFL)，屬于轉化生長因子β(TGF-β)的超家族，同時ARTN也是分泌性的磷酸化糖蛋白，具有促進細胞趨化、粘附及遷移的作用[3-5]，ARTN與信號轉導通路中的分子結合后會產生級聯放大效應，在介導腫瘤細胞的侵襲、轉移中具有重要意義。本研究旨在采用免疫組化法[6]和熒光定量PCR技術[7]檢測Artemin在胃癌組織中的表達，分析ARTN表達強度與腫瘤臨床病理特征的關系，探索Artemin在伴隨胃癌發生、發展或轉移過程中的變化。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年3月至2014年9月在我院進行手術治療切除的胃癌組織標本90例，其中男性患者40例，女性患者50例，年齡36～77歲，平均(45.5±1.4)歲，患者手術前均未接受化療、放療、免疫或放射治療，術后均經過至少兩名病理醫師獨立進行病理學診斷確診為胃癌。標本來源病例均具備完整的臨床病理特征及隨訪資料。其中，參照2010年WHO組織學標準[8]分為腸型胃癌與彌漫型胃癌，其中57例腸型胃癌中，乳頭狀腺癌2例，高分化管狀腺癌24例、中分化管狀腺癌31例；43例彌漫型胃癌中，印戒細胞癌8例，低分化腺癌35例；參照2010年美國癌癥聯合會(AJCC)和國際抗癌聯盟(UICC)修訂的第7版TNM分期法[9]對患者進行分類，其中，Ⅰ期18例、Ⅱ期24例、Ⅲ期23例、Ⅳ期25例。同時，選取30例胃癌患者，其中，男性患者12例，女性患者18例，年齡35～75歲，平均（50.5±11.3）歲，取其癌旁組織（即距離胃癌腫瘤5cm以上的周圍組織）為對照標本，所有患者手術前均未接受化療、放療、免疫或放射治療，術后均經過至少兩名病理醫師獨立進行病理學診斷確診為胃癌，且標本來源病例均具備完整的臨床病理特征及隨訪資料。

1.2 納入標準 目前國內外還沒有統一的胃癌納入標準，由于胃癌缺少特異性的臨床癥狀，且早期胃癌常不具明顯癥狀，患者一般會出現上腹部不適或疼痛、食欲減退、消瘦、乏力、惡心、嘔吐或黑便、腹瀉、發熱、腹部出現腫塊等癥狀，晚期轉移時，左鎖骨上淋巴結則會伴有腫大現象，這些癥狀往往會伴隨著胃癌的發生、發展過程。臨床上胃癌的診斷主要依據胃液檢查、大便隱血試驗、X線鋇餐檢查、纖維胃鏡檢查、影像學以及病理學檢查。

1.3 排除標準 (1)沒有完整臨床病例資料；(2)圍手術期死亡者；(3)局部復發及殘余的胃癌患者；(4)在術前應用新輔助治療者。

1.4 方法

1.4.1 免疫組化法檢測Artemin蛋白 標本采集：選取腫瘤中心壞死部分為腫瘤組織標本，距離腫瘤組織邊緣5cm以上為癌旁組織，選取該癌旁組織作為正常對照。將組織標本取出立即加入到10%中性甲醛溶液中固定，然后進行常規脫水、石蠟包埋保存。測定步驟：將胃癌組織及癌旁正常組織標本進行石蠟切片進行枸櫞酸加熱、抗原修復后按照Artemin蛋白(ARTN)檢測試劑盒(北京華夏雄風科技有限公司)說明書步驟檢測Artemin蛋白。其中，用已知陽性片作為陽性對照，以pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。一抗反應條件為4℃過夜，二抗條件為37℃，孵育30min，添加DAB試劑(北京中衫生物制品有限公司)，顯色5min，蘇木精富染、脫水、透明并封固。

1.4.2 免疫組化染色結果判定標準 將標本切片置于顯微鏡下，對所測的視野進行準確定位之后由攝像系統進行圖象分析，并由兩名病理醫師獨立進行判定。由于ARTN的陽性表達主要位于細胞質與細胞膜處，因此細胞膜與細胞質染色后出現明顯的黃色或者棕黃色顆粒則判定為陽性，隨機選取每張切片的5個(×400)的高倍視野，記錄陽性細胞百分率，視野無著色細胞則為陰性(-)；陽性著色細胞率＜25%為弱陽性(+)；著色細胞細胞率為25%～50%則為陽性(++)；陽性著色細胞率＞50%為強陽性(+++)。

1.4.3 實時熒光定量PCR檢測Artemin mRNA的表達 用Trizol試劑(MIC公司)抽提標本總RNA，以oligo(dT)18為引物(上海生工生物工程技術服務有限公司合成)反轉錄合成CDNA第一鏈。PCR反應條件：95℃預變性2min，95℃變性30 s，69℃退火30 s，57℃30 s、72℃熒光檢測1min，重復36個循環，72℃5min，在熒光定量PCR儀(天隆科技有限公司，TL988-Ⅰ型)上進行實時定量PCR檢測。引物生成，內參β-actin上游5'-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3'，下游5'-ATCTTCAAACCTCCATGATA-3'，產物136 bp。Artemin上游5'-TGGCCGCTCTGG-CTCTGCTGA-3'，下游5'-TGAGGTCTGGTGTCTTTT AGG-3'，產物382 bp。并計算胃癌Artemin mRNA表達的倍數，目的基因的mRNA相對表達水平用2-△Ct表示(△Ct=目的基因Ct值-β-actin基因Ct值)。

1.5 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件進行數據分析，計數資料采用χ2檢驗，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 Artemin蛋白在胃癌組織及癌旁組織中的表達 免疫組化結果見圖1，結合表1可知，在90例胃癌組織中的Artemin陽性71例，其陽性率為78.89%；在30例癌旁組織中Artemin陽性3例，陽性率為10.00%，Artemin在胃癌組織中的陽性率明顯高于在癌旁組織的陽性率，差異有統計學意義(P＜0.01)。

圖1 免疫組化法觀察到Artemin蛋白在組織中的表達

表1 Artemin在胃癌組織和癌旁組織中的表達

2.2 Artemin蛋白在胃癌組織中的表達與其臨床病理特征的關系 由表2可知，Artemin蛋白在胃癌組織中的表達與胃癌患者的腫瘤浸潤程度、淋巴結轉移及臨床TNM分期有密切關系(P＜0.05)，而與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤大小及分化程度均無關(P＞0.05)。

表2 Artemin在胃癌中的表達與臨床病理特征的關系[例（%）]

2.3 Artemin mRNA在胃癌組織及癌旁組織中的表達結果 由表3可知，以癌旁組織中的β-Actin mRNA量為1，計算出Artemin mRNA在胃癌組織中的表達量是在癌旁組織中的7.01倍。

表3 胃癌組織及癌旁組織中Artemin mRNA表達的比較(±s)

表3 胃癌組織及癌旁組織中Artemin mRNA表達的比較(±s)

注：a△Ct=Ct目的基因-Ctβ-Actin。

項目2-△Ct倍數組織細胞類型Ct -△Ctaβ-Actin Artemin癌旁組織胃癌組織癌旁組織21.37±3.7522.57±3.4625.38±5.230 -1.20 -4.011 --7.010.43530.0621

3 討 論

腫瘤的轉移過程是一個多步驟、多階段的復雜過程，與腫瘤細胞的增殖能力、運轉能力及侵襲能力關系密切，且腫瘤細胞極易侵襲性生長、轉移和復發。目前關于胃癌的具體發病機制以及其發生發展過程中細胞、基因中的等相關指標變化還未闡明清楚，從基因和蛋白水平出發，現代研究[10-12]已證明，Artemin蛋白、vegf165b重組蛋白、MMP-9、骨橋蛋白、COX-2蛋白、整合素α5β1蛋白在胃癌組織中的表達與胃癌的發生、發展及淋巴轉移等有密切關聯。

研究表明[6]，Artemin是由113個氨基酸及7個保守的半胱氨酸殘基組成，且傾向于結合GFRα3受體，形成受體復合物，再通過糖基-磷脂酰肌醇結合于細胞膜，激活Ret，進而傳遞信號，一旦與信號轉導通路中的分子結合后將會產生級聯放大效應，促進腫瘤的侵襲與轉移。臨床研究[13-15]也同樣發現，Artemin蛋白在胰腺癌中高度表達，在乳腺癌的侵襲轉移過程中發揮了至關重要的作用，Artemin蛋白的表達可能與乳腺癌的疾病進展、侵襲和遠處轉移有密切的聯系，Artemin蛋白的表達也能夠影響食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。

本研究結果Artemin蛋白在胃癌組織中的陽性表達率明顯高于癌旁的良性組織，差異具有顯著性意義，提示Artemin蛋白的異常表達與胃癌的發生有一定的關系；Artemin蛋白在胃癌組織中的表達與胃癌患者的腫瘤浸潤程度、淋巴結轉移及臨床TNM分期有密切關系(P＜0.05)，而與胃癌患者的性別、年齡、腫瘤大小及分化程度無關(P＞0.05)，推測Artemin蛋白的高表達可能是對腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲演變過程中的一種反映；Artemin mRNA在胃癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，推測Artemin蛋白參與了胃癌的發生或發展的過程。

綜上所述，Artemin蛋白在一定程度上可能參與了胃癌的發生發展，與胃癌的侵襲轉移有關，推測Artemin蛋白可作為監測中國人群胃癌的發生、轉移、侵襲及預后情況的有效指標之一，具體的機制有待進一步研究。

[1]鄭朝輝,陸 俊,黃昌明,等.青年胃癌的臨床病理特征及其預后分析[J].中華胃腸外科雜志,2013,16(1)：40-44.

[2]Kodama M,Kitadai Y,Sumida T,et al.Expression of platelet-derived growth factor(PDGF)-B and PDGF-receptorβis associated with lymphatic metastasis in human gastric carcinoma[J].Cancer Sci,2010,101(9)：1984-1989.

[3]李書軍,和宇崢,閏洪江,等.SiRNA沉默Artemin蛋白對食管癌TEl1細胞侵襲能力的影響[J].中國腫瘤臨床,2010,37(24)：1432-1436.

[4]Sumida T,Kitadai Y,Shinagawa K,et al.Anti-stromal therapy with imatinib inhibits growth and metastasis of gastric carcinoma in an orthotopic nude mouse model[J].Int J Cancer,2011,128(9)：2050-2062.

[5]Liu MF,Jin T,Shen JH,et al.NGAL and NGAL are frequently overexpressed in human gliomas and are associated with clinical prognosis[J].J Neurooncol,2011,104(1)：119-127.

[6]Wang HJ,He XJ,Ma YY,et al.Expressions of neutrophil gelatinase associated lipocalin in gastric cancer：a potential biomarker for prognosis and an ancillary diagnostic test[J].Anat Rec(Hoboken),2010,293(11)：1855-1863.

[7]戴 敏,吳正升,孟 剛.Artemin在乳腺癌中的表達及意義[J].腫瘤學雜志,2011,17(11)：843-846.

[8]余 勝,吳芳郭,郭 坤,等.磷脂酶Cε1在胃癌組織中的表達及與胃癌患者預后的關系[J].中華胃腸外科雜志,2014,17(4)：378-383.

[9]李 濤,馮道夫,梁美霞,等.進展期胃癌應用SOX方案新輔助化療對腫瘤NM分期的影響[J].世界華人消化雜志,2014,22(2)：249-252.

[10]Bolignano D,Donato V,Lacquaniti A,et al.Neutrophil gelatinase associated lipocalin(NGAL)in human neoplasias：a new protein enters the scene[J].Cancer Lett,2010,288(1)：10-16.

[11]姚海波,徐 園,陳樂高,等.醛酮還原酶l-B10在胃癌組織中的表達及其臨床意義[J].中華胃腸外科雜志,2013,16(2)：183-189.

[12]曹學全,盧洪勝,章 輝,等.胃癌組織Artemin和MMP-9表達與浸潤轉移相關性分析[J].中華腫瘤防治雜志,2013,20(4)：266-269.

[13]李 萌,戴衛健,于小妹,等.組織及血清中NGAL水平與胃癌臨床病理特征的相關性研究[J].醫學研究雜志,2013,42(6)：41-43.

[14]祁曉莉,戴 潔,喬 星,等.胃癌變過程中幽門螺桿菌感染與Ki67和P27蛋白表達的意義[J].臨床和實驗醫學雜志,2013,12 (21)：1711-1714.

[15]孟令新,丁兆軍,陳希平,等.Artemin及其受體GFRα3在胰腺導管癌組織中的表達及意義[J].中華胰腺病雜志,2011,11(1)：24-28.

Expression of Artemin protein in gastric carcinoma tissues and its relationship with the clinicopathological features.

MA Yao-xian.Department of Oncology,the Central Hospital of Xuchang,Xuchang461000,Henan,CHINA

ObjectiveTo investigate expression of Artemin protein in gastric carcinoma tissues and its relationship with the clinicopathological features.MethodsThe expression of Artemin protein was detected by immunohistochemistry in gastric carcinoma tissues(from90 patients of gastric cancer,the study group)and peficancerous tissues(from30 patients of gastric cancer,the control group).The relationship of Artemin protein with the clinicopathological features of gastric carcinoma patients was analyzed.The expression difference ofArtemin mRNAin gastric carcinoma tissues and peficancerous tissues was also analyzed.ResultsThe positive expression of Artemin protein in gastric carcinoma tissues was significantly higher than that in peficancerous tissues(78.89%vs10.00%,P＜0.05).The expression of Artemin protein in gastric carcinoma tissues was correlated with TNM stage,infiltration depth and lyrmoh node tastasis(P＜0.05),but not correlated with age,sex,tumor size or degree of differentiation(P＞0.05).The expression of Artemin mRNA in gastric carcinoma tissues was7.01 times higher than that in the peficancerous tissues, which indicates that Artemin plays a role in the development of gastric carcinoma.ConclusionThe expression of Artemin protein in gastric carcinoma significantly correlates with tumor invasion and metastasis,which could be used as one of the indicators for the clinical evaluation of gastric cancer progression and the prognosis of patients.

Gastric carcinoma;Artemin protein;Immunohistochemistry;Clinicopathological features

R735.2

A

1003—6350（2015）16—2355—04

2015-01-28)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.16.0850

馬耀先。E-mail：mayaoxian@csco.org.cn