年齡和性別對健康人群外周血I型干擾素基因表達的影響

牛志立，張平安，童永清

(武漢大學人民醫院檢驗科，湖北 武漢 430060)

年齡和性別對健康人群外周血I型干擾素基因表達的影響

牛志立，張平安，童永清

(武漢大學人民醫院檢驗科，湖北 武漢 430060)

目的 觀察不同性別和年齡健康人外周血單個核細胞（PBMC）中I型干擾素mRNA表達，探討I型干擾素基因表達的性別和年齡差異。方法選擇113例健康人，中老年54例包括女性27例和男性27例，平均(63±8)歲；青年人59例包括女性30例和男性29例，平均(36±6)歲。取抗凝全血，實時熒光定量PCR檢測干擾素α(IFN-α)和干擾素β(IFN-β)的mRNA表達。結果健康中老年男性IFN-α和IFN-β基因表達量與青年男性比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)，且前者基因表達量分別比后者低25倍和2.9倍；健康中老年女性IFN-α和IFN-β基因表達量與青年男性比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)，且前者基因表達量分別比后者低6.67倍和3.57倍；健康青年男性IFN-α和IFN-β基因表達量與青年女性比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)，且前者基因表達量分別比后者低4倍和1.92倍；健康中老年男性IFN-α基因表達量和中老年女性比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，且前者基因表達量比后者低16.67倍，但健康中老年男性IFN-β基因表達量和中老年女性比較，差異無統計學意義(P＜0.05)。結論性別和年齡對I型干擾素表達有一定的影響，為臨床研究免疫相關性疾病的發病機制提供理論基礎。

健康人群；外周血單個核細胞；I型干擾素；實時熒光定量PCR

性別長期以來被認為與免疫功能有很大關系。最近有研究表明丙肝病毒(HCV)女性感染者有更強的清除能力和持續病毒學應答(Sustained virologic response，SVR)[1-2]。對于病毒感染而言，男性血清IgG、IgM和IgA的基線水平相對于女性顯著減少[3]。此外，對于獲得感染性疾病的男性比女性具有較高的TNF-α(Tumor necrosis factor)，導致男性的疾病更嚴重，而女性患者的炎癥水平比男性高，這意味著女性比男性表現出更強的免疫反應[4-5]。研究HIV(Human immunodeficiency virus)的結果表明，未治療的女性比男性的生存率要低而且女性比男性具有較低的病毒載量，有趣的是，病毒控制的女性患者在5～7年內病毒載量比男性上升的速度要快的多[6-7]，這說明病毒載量在不同性別是不一致的。

Ⅰ型干擾素包括IFN-α和IFN-β，具有抑制病毒復制、抗寄生蟲、抑制多種細胞增殖、刺激免疫細胞的殺傷活性、參與免疫調節、抗腫瘤等作用[8]。病毒感染人體后，可通過Toll受體或其他受體的識別激活I型干擾素，激活的Ⅰ型干擾素基因表達的蛋白激活JAK-STAT信號通路，最終激活干擾素誘導基因(Interferon stimulated gene，ISG)的表達而發揮抗病毒作用[8-9]。目前關于雌激素與Ⅰ型干擾素之間的研究，尤其對女性絕經期和非絕經期的研究國內外較少，本文將從性別和年齡的角度對絕經期和非絕經期的健康人群的女性和年齡匹配的男性進行Ⅰ型干擾素基因表達的研究和比較，觀察是否健康女性Ⅰ型干擾素的表達水平比男性具有較高的基礎水平，分析是否易感性取決于不同性別人群的干擾素不同，最終為臨床研究免疫相關性疾病的發病機制提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年3月至2014年8月在武漢大學人民醫院體檢的113例健康人，按照世界衛生組織年齡劃分標準分為中老年組(年齡＞45歲)和青組(＜45歲)[10]。中老年人包括女性27例和男性27例，年齡51～74歲，平均(63±8)歲，青年人包括女性30例和男性29例，年齡25～43歲，平均(36±6)歲。本研究經我院倫理委員會批準[編號：(2013)鄂倫字(KY-035)]，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 淋巴細胞分離液由天津美德太平洋科技有限公司提供，Trizol和SYBR Premix ExTaqⅡ由TaKaRa公司提供，反轉錄試劑盒由Thermo SCIENTIFIC公司提供。PCR分析儀由Applied Biosystem Inc公司生產；VII7熒光定量分析儀由ABI公司生產。

1.3 研究方法

1.3.1 引物設計 利用美國國立生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)網站中提供的IFN-α和IFN-βmRNA序列和BLAST進行引物設計，見表1。所有引物均由上海維基生物科技有限公司合成。

表1 基因IFN-α，IFN-β和GAPDH的上下游引物

1.3.2 mRNA提取和逆轉錄 采集所有研究對象空腹靜脈血2ml于EDTA抗凝的采血管中，按照淋巴細胞分裂液說明書(天津美德太平洋科技有限公司)提取2ml外周血單個核細胞(PBMC)并用Trizol法提取PBMC總mRNA。取11 μl RNA模板進行逆轉錄，加入1μl oligo引物混勻并瞬時離心，65℃5min，反應體系：4μl Reaction Buffer，2 μl Mix，1μl RI，1μlRT。反應條件：42℃60min，72℃10min，4℃保存。得到的cDNA產物放置在-20℃保存備用。

1.3.3 熒光定量PCR檢測 反應體系為cDNA1μl，上下游引物各lμl，SYBR Premix ExTaqⅡ10μl，ROXⅡ0.4μl，ddH2O7.6 ul，總體積為20μl。3個基因(IFN-α，IFN-β，GAPDH)擴增反應條件均為94℃30 s預變性，94℃20 s，60℃20 s，72℃35 s，50個循環，溶解曲線條件：95℃15 s，60℃1min，95℃15 s。擴增效率驗證：本實驗對3個基因(IFN-α、IFN-β、GAPDH)進行了10倍稀釋，稀釋5個梯度，目的基因和內參基因擴增效率相差小于5%，且在98%～102%之間，可以認為擴增效率近似相等[11]。

1.4 統計學方法 應用SPSS20.0軟件對數據進行統計分析，計量資料呈正態分布且方差齊性的資料以均數±標準差(x-±s)表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Ⅰ型干擾素基因mRNA在中老年組和青年組間的表達情況 健康中老年男性IFN-α和IFN-β基因表達量與青年男性比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)，并且其基因表達量分別比后者低25倍和2.9倍。健康中老年女性IFN-α和IFN-β基因表達量與青年男性比較差異均有統計學意義(P＜0.05)，并且其基因表達量分別比后者低6.67倍和3.57倍，見表2。

表2 I型干擾素基因mRNA在中老年組和青年組間的表達情況(±s)

表2 I型干擾素基因mRNA在中老年組和青年組間的表達情況(±s)

注：2-△△Ct表示表達量的倍比關系，△△Ct=△Ct中老年組-△Ct青年組。

組別IFN-β(△Ct)男性 女性IFN-α(△Ct)IFN-β(△Ct)IFN-α(△Ct)中老年組青年組2-△△Ctt值P值9.09±2.107.27±1.3528/1003.940.000115.60±2.9010.87±2.594/1006.430.00019.77±1.238.20±1.2634/1004.720.000111.64±2.408.90±1.3915/1005.340.0001

2.2 Ⅰ型干擾素基因mRNA在女性組和男性組間的表達情況 健康青年男性IFN-α和IFN-β基因表達量與青年女性比較差異均有統計學意義(P＜0.05)，并且其基因表達量分別比后者低4倍和1.92倍。健康中老年男性IFN-α基因表達量和中老年女性比較差異有統計學意義(P＜0.05)，并且其基因表達量比后者低16.67倍。但是健康中老年男性IFN-β基因表達量和中老年女性比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見表3。

表3 I型干擾素基因mRNA在女性組和男性組間的表達情況(±s)

表3 I型干擾素基因mRNA在女性組和男性組間的表達情況(±s)

注：2-△△Ct表示表達量的倍比關系，△△Ct=△Ct男性組-△Ct女性組。

組別 青年 中老年IFN-α(△Ct)IFN-β(△Ct)IFN-α(△Ct)IFN-β(△Ct)男性組女性組2-△△Ctt值P值10.89±2.588.90±1.3925/1003.670.0018.20±1.267.27±1.3552/1002.710.00915.60±2.9011.64±2.46/1005.470.00019.77±1.239.09±2.1062/1001.450.15

3 討論

有研究報道[2，12-13]，不同性別的人感染病毒后對I型干擾素的表達和治療反應不同，導致病毒的清除能力也不一致，如HCV感染的女性比HCV感染的男性具有較高的病毒自我清除能力，并且對抗病毒治療的效果也不相同。如果對女性進一步分析發現[12-13]，年輕女性比老年女性獲得更高的持續病毒學應答，但是青年男性和老年男性之間并無差別。對HCV感染的老年男性和老年女性研究發現[13]，經過抗病毒治療的老年男性要比抗病毒治療的老年女性更易獲得持久病毒學應答反應，但是他們都不如絕經前的女性更易獲得持久的病毒學應答反應。有研究發現，HIV感染的女性比男性具有較高的IFN-α水平，IFN-α上調CD8+T細胞上的CD38分子，這有利于免疫細胞的激活并且增加女性的死亡率[6-7，14]。

有研究表明[5，15]，女性比男性具有更強的抗病毒感染能力，這與雌激素具有增強免疫功能的作用有很大的關系，并且隨著年齡的增長，性激素水平下降，對免疫的調節作用減弱，導致老年人免疫力下降。有研究報道[16-17]，與對照的健康女性相比，TLR7激動劑咪喹莫特(Imiquimod)刺激健康男性的PBMC不會增加IFNα的分泌。本次研究發現，健康青年女性比中老年女性具有較高的IFN-β表達水平，同時比青年男性具有較高的IFN-α和IFN-β基因表達水平。對于男性而言，健康青年男性比中老年男性具有較高的IFN-α和IFN-β基因表達水平。除此之外，本實驗發現中老年男性比中老年女性具有較高的IFN-α基因表達水平，但是IFN-β基因表達在兩者之間沒有差異，這可能與研究對象例數較少等原因有關，其具體機制還需要進一步研究。

最近研究發現[18-19]，雌激素受體與Toll樣受體具有協同作用，共同參與病毒的識別和信號傳遞，雌激素通過經典或非經典途徑激活雌激素反應元件，經NF-kB因子的活化最終激活I型干擾素。從本文的研究結果可以看出，青年女性比男性具有更高的Ⅰ型干擾素表達水平，在一定程度上對女性的抗病毒和免疫功能的調節起到很大的作用，這可以為臨床上研究免疫相關性疾病的發病機制提供參考。

[1]Bernabucci V,Villa E.The role played by gender in viral hepatitis [J].Scand J Clin Lab Invest Suppl,2014,244：90-94.

[2]Bakr I,Rekacewicz C,El Hosseiny M,et al.Higher clearance of hepatitis C virus infection in females compared with males[J].Gut,2006,55：1183-1187.

[3]Marriott I,Huet-Hudson YM.Sexual dimorphism in innate immune responses to infectious organisms[J].Immunol Res,2006,34(3)：177-192.

[4]Howie SE.Go girls!Efficient female innate immunity[J].Blood,2011,118(22)：5718-5719.

[5]Ngo ST,Steyn FJ,Mc Combe PA.Gender differences in autoimmune disease[J].Front Neuroendocrinol,2014,35(3)：347-369.

[6]Meier A,Chang JJ,Chan ES,et al.Sex differences in the Toll like receptor-mediated response of plasmacytoid dendritic cells to HIV-1 [J].Nat Med,2009,15(8)：955-959.

[7]Meditz AL,MaWhinney S,Allshouse A,et al.Sex,race,and geographic region influence clinical outcomes following primary HIV-1 infection[J].J Infect Dis,2011,203(4)：442-451.

[8]Ivashkiv LB,Donlin LT.Regulation of type I interferon responses [J].Nat Rev Immunol,2014,14(1)：36-49.

[9]Lester SN,Li K.Toll-like receptors in antiviral innate immunity[J]. Mol Biol,2014,426(6)：1246-1264.

[10]夢 娜.人類年齡段劃分新標準[J].現代養生,2005,9：16.

[11]Pfaffl MW.A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCRJ.NucleicAcids Res,2001,29(9)：e45.

[12]Baden R,Rockstroh JK,Buti M.Natural history and management of hepatitis C：does sex play a role?[J].J Infect Dis,2014,209 (Suppl3)：81-85.

[13]Villa E,Karampatou A,Camma C,et al.Early menopause is associated with lack of response to antiviral therapy in women with chronic hepatitis[J].Gastroenterology,2011,140(3)：818-829.

[14]Rodriguez B,Lederman MM,Jiang W,et al.Interferon-alpha differentially rescues CD4 and CD8 T cells from apoptosis in HIV infection[J].AIDS,2006,20(10)：1379-1389.

[15]Furman D.Sexual dimorphism in immunity：improving our understanding of vaccine immune responses in men[J].Expert Rev Vaccines,2015,14(3)：461-471.

[16]Fawzy IO,Negm M,Ahmed R,et al.Tamoxifen alleviates hepatitis C virus-induced inhibition ofboth toll-like receptor7 and JAK-STAT signalling pathways in PBMCs of infected Egyptian females[J].J Viral Hepat,2012,19(12)：854-861.

[17]Bergh?fer B,Frommer T,Haley G,et al.TLR7 ligands induce higher IFN-alpha production in females[J].J Immunol,2006,177(4)：2088-2096.

[18]Cunningham MA,Wirth JR,Naga O,et al.Estrogen Receptor Alpha Binding to ERE is Required for Full Tlr7-and Tlr9-Induced Inflammation[J].SOJ Immunol,2014,2(1)：1-7.

[19]Seillet C,Laffont S,Trémollières F,et al.The TLR-mediated response of plasmacytoid dendritic cells is positively regulated by estradiolin vivothrough cell-intrinsic estrogen receptorαsignaling [J].Blood,2012,119(2)：454-464.

Effect of age and gender on the expression of typeⅠinterferon gene in peripheral blood of healthy people.

NIU Zhi-li,ZHANG Ping-an,TONG Yong-qing.Department of Laboratory Science,Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo explore the effects of gender and age on the expression of typeⅠinterferon by investigating the expression of typeⅠinterferon mRNA in peripheral blood mononuclear cells(PBMC)of healthy individuals.MethodsPeripheral blood samples were collected from113 healthy individuals,which consisted of54 middle-and old-aged participants[27 females and27 males,with the mean age of(63±8)years old]and59 young participants[30 females and29 males,with the mean age of(36±6)years old].Expression levels of interferon-α(IFN-α)and interferon-β(IFN-β)mRNA were detected by real-time quantitative PCR.ResultsThe mRNA expression of gene IFN-αand IFN-βwere significantly different between healthy middle-and old-aged males and young males(P＜0.05),and the gene expression of the former was25 and2.9 times lower than the latter,respectively.The mRNA expression of gene IFN-αand IFN-βshowed significant difference between healthy middle-and old-aged females and young females(P＜0.05),and the gene expression of the former was6.67 and3.57 times lower than the latter,respectively.The mRNA expression of gene IFN-αand IFN-βwere significantly different between healthy young males and young females(P＜0.05),and the gene expression of the former was4 and1.92 times lower than the latter,respectively.The mRNA expression of gene IFN-αwas significantly different between healthy males and females of middleand old-age(P＜0.05),and the gene expression of the former was16.67 times lower than the latter.However,the expression of IFN-βgene showed no statistically significant differences between middle-and old-aged males and females(P＜0.05).ConclusionGender and age discrepancies have a relationship with the expression of typeⅠinterferon,which may provide a theoretical basis for the pathogenesis of clinical studies of immune related diseases.

Healthy individuals;Peripheral blood mononuclear cells;TypeⅠinterferon;Real-time quantitative PCR

R446.6

A

1003—6350（2015）16—2400—03

2014-10-17)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.16.0865

張平安。E-mail：zhangpingan@aliyun.com