CD8+CD28+Tc細胞在急性白血病患者化療前后外周血中的表達及臨床意義

周靜，陳建安，丁茜，何永明，吳東升，陳麗莉

(中山大學附屬東華醫院檢驗科1、血液內科2，廣東東莞523110)

CD8+CD28+Tc細胞在急性白血病患者化療前后外周血中的表達及臨床意義

周靜1，陳建安1，丁茜1，何永明1，吳東升2，陳麗莉1

(中山大學附屬東華醫院檢驗科1、血液內科2，廣東東莞523110)

目的探討CD8+CD28+Tc細胞在急性白血病患者化療前后外周血中的表達及其臨床意義。方法應用流式細胞術檢測急性白血病初診患者40例，化療后完全緩解患者30例和健康體檢者30例的外周血CD8+CD28+Ts細胞的表達情況。結果急性白血病初診患者外周血中CD8+CD28+Tc細胞的表達率為(7.83±4.83)%，較健康對照組表達率[(14.92±4.13)%]明顯偏低，差異具有統計學意義(P＜0.01)；化療后完全緩解患者外周血CD8+CD28+Tc細胞的表達率為(8.21±5.68)%，較健康對照組明顯偏低，差異具有統計學意義(P＜0.01)；完全緩解組外周血CD8+CD28+Tc細胞的表達率與初診患者組比較差異無統計學意義(P＞0.05)；緩解組CD8+T細胞的表達率為(43.87±16.47)%，均比初診患者組[(31.53±7.25)%]和健康對照組[(33.65±7.08)%]的表達率明顯偏高，差異具有統計學意義(P＜0.01)；急性髓細胞白血病(AML)和急性淋巴細胞白血病(ALL)的外周血CD8+CD28+Tc細胞的表達率分別為(7.90±4.63)%和(6.47±2.86)%，均明顯低于健康對照組，差異均具有統計學意義(P＜0.01)；CD8+CD28+Tc細胞與CD8+T細胞的直線回歸相關系數r=0.098，差異無統計學意義(P＞0.05)，其無正相關關系。結論CD8+CD28+Tc細胞在急性白血病初診患者和化療后完全緩解患者的外周血中表達明顯偏低，提示其抗腫瘤能力下降，需要通過有效干預患者的免疫功能，提高機體的抗腫瘤能力，對提高急性白血病的療效有重要意義。

急性白血病；腫瘤；外周血；CD8+CD28+Tc

目前認為免疫系統的免疫監視是抗腫瘤作用的第一道防線，有研究[1]結果表明，腫瘤組織內浸潤的免疫細胞數量越多，其抗腫瘤作用越明顯，預后更好。CD8+CD28+Tc細胞是一種殺傷性免疫細胞，對腫瘤的免疫監視及殺傷中起重要作用，急性白血病作為惡性非實體性腫瘤，其外周血的分布情況及其免疫抑制中的作用目前尚不清楚。本研究通過對急性白血病患者治療前和化療后CD8+CD28+Tc細胞在外周血表達水平的變化規律，探討CD8+CD28+Tc細胞的抗腫瘤作用，為有效干預患者的免疫功能提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2013年5月至2014年5月前來我院就診的初診急性白血病患者40例，抽取外周乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血2 ml，同時抽取骨髓液涂片送檢做骨髓形態學和組織化學分析，并抽取肝素抗凝骨髓液送檢用流式細胞儀做白血病免疫分型，從而確診急性白血病和分型，其中男性23例，女性17例，年齡16～65歲。選取部分在我院化療后完全緩解者30例，同時選擇健康體檢人群30例，抽取外周EDTA抗凝全血。

1.2 試劑與儀器儀器為美國貝克曼-庫爾特公司的FC500 MCL流式細胞儀，日本奧林巴斯BX-51型顯微鏡；試劑為廣州康潤試劑公司提供的貝克曼-庫爾特公司生產的CD45-藻紅蛋白-花青苷7 (Phycoerythrin cyanin 7，PC7)/CD28-異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)/CD8-藻紅蛋白(Phycoerythrin，PE)等熒光抗體試劑，磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate buffered solution，PBS)，紅細胞裂解液。

1.3 檢測方法分別加入CD45-pc7、CD8-PE、CD28-FITC熒光抗體試劑各5μl至同一流式專用管內底端，同時加入50μl抗凝全血避光反應20 min，加入RBC裂解液500μl，避光20 min后加入PBS上機檢測，用CD45/SS設門圈定淋巴細胞群，在十字門圖中分析CD8+而CD28-性區域細胞的百分比，即為CD8+CD28-Ts細胞表達率；在CD8+而CD28+性區域的百分比，即為CD8+CD28+Tc細胞表達率；在CD8+性區域的百分比，即為CD8+T細胞表達率。

1.4 統計學方法應用SPSS11.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差±s)表示，兩組間比較采用t檢驗，以α=0.05為檢驗水準，線性回歸方法分析CD8+CD28+Tc細胞與CD8+T細胞的關系，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組受試者間的CD8+CD28-Ts細胞表達率比較初診患者組和化療后完全緩解組的外周血CD8+CD28+Tc細胞的表達率均明顯低于健康對照組(t= 5.68、4.35，P＜0.01)；完全緩解組外周血CD8+CD28+Tc細胞的表達率與初診患者組比較差異無統計學意義(t=0.286，P＞0.05)，且CD8+T細胞的表達率均明顯高于健康對照組和初診患者組(t=2.985、4.556，P＜0.01)，見表1。

表1 各組受試者間的CD8+CD28+Tc細胞表達率比較(±s，%)

表1 各組受試者間的CD8+CD28+Tc細胞表達率比較(±s，%)

注：與健康對照組比較，aP＜0.01；完全緩解組與初診患者組比較，bP＜0.01。

組別例數C D8+C D28+T c細胞C D8+T細胞初診患者組完全緩解組健康對照組4 0 3 0 3 0 7 . 8 3 ± 4 . 8 3a8 . 2 1 ± 5 . 6 8a1 4 . 9 2 ± 4 . 1 3 3 1 . 5 3 ± 7 . 2 5 4 3 . 8 7 ± 1 6 . 4 7ab3 3 . 6 5 ± 7 . 0 8

2.2 初診患者急性髓細胞白血病[AML，不包括急性早幼粒細胞白血病(APL)]、APL和急性淋巴細胞白血病(ALL)與健康對照組間CD8+CD28+Tc細胞表達率比較AML和ALL外周血CD8+CD28+Tc細胞的表達率均明顯低于健康對照組(t=5.138、4.667，P＜0.01)；APL組的CD8+T細胞表達率明顯低于健康對照組(t=2.852，P＜0.01)；AML和ALL組的CD8+T細胞的表達率均明顯高于APL組(t=2.112、2.080，P＜0.05)，見表2。

表2 AML(不包括APL)、APL和ALL與健康對照組間CD8+CD28+Tc細胞表達率比較(±s，%)

表2 AML(不包括APL)、APL和ALL與健康對照組間CD8+CD28+Tc細胞表達率比較(±s，%)

注：與健康對照組比較，aP＜0.01；與APL比較，bP＜0.05。

組別例數C D8+C D28+T c細胞C D8+T細胞A M L (不包括A P L ) A L L A P L健康對照組2 8 6 6 3 0 7 . 9 0 ± 4 . 6 3a6 . 4 7 ± 2 . 8 6a1 0 . 5 8 ± 6 . 2 3 1 4 . 9 2 ± 4 . 1 3 3 2 . 7 2 ± 6 . 9 3b3 0 . 8 7 ± 4 . 4 5b2 6 . 6 2 ± 1 0 . 1 5a3 3 . 6 5 ± 7 . 0 8

2.3 急性白血病患者CD8+CD28+Tc細胞與CD8+T細胞的關系CD8+CD28+Tc細胞與CD8+T細胞的直線回歸相關系數r=0.098，相關系數顯著性檢驗P＞0.05，差異無統計學意義，其無正相關關系，見圖1。

圖1 CD8+CD28+Tc細胞與CD8+T細胞的直線回歸關系圖

3 討論

CD28分子為細胞共刺激分子，表達于95%的CD4+和50%～95%的CD8+T細胞上，能與抗原提呈細胞上的B7分子結合所介導的共刺激信號協助激活T細胞的增殖和包括IL-2在內的多種淋巴因子的分泌，并能阻止細胞無反應性的誘導。CD8+T細胞根據CD28的表達與否分為細胞毒性T細胞(CD8+CD28+)和抑制性T細胞(CD8+CD28+)。CD8+CD28+T細胞主要為激活的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，與腫瘤直接接觸，通過排粒作用釋放穿孔素和顆粒酶等細胞毒性物質，溶解靶細胞；同時還可能釋放一些細胞因子誘導靶細胞凋亡[2]。在機體內，CTL的活化需要雙信號刺激，首先腫瘤細胞通過表面的MHCI-腫瘤抗原肽復合物與TCR-CD3結合形成活化的第一信號；同時腫瘤表面上的協同刺激分子，如B7、細胞間粘附分子1、淋巴細胞功能相關分子-3(LFA-3)等，與CTL上相應的分子受體CD28、LFA-1及LFA-2等結合形成活化的第二信號。CD8+CD28+Tc細胞減少及CD8+CD28-Ts細胞增加是T淋巴細胞功能下降的標志[3-4]。CD8+CD28+Tc細胞數量顯著減少，導致機體缺乏有效的“第二信使”來活化CD8+T細胞，從而使機體免疫功能下降[5-6]。

有文獻[7-10]報道CD8+CD28+Tc細胞在多種腫瘤患者的外周血表達比例降低，劉曉光等[7]報道了51例結腸癌患者外周血CD8+CD28+Tc細胞較健康對照組有明顯降低，分別為(8.60±3.95)%和(13.37±2.78)% (P＜0.01)。宋丁等[8]報道了38例原發性肝癌患者外周血CD8+CD28+Tc細胞較健康對照組有明顯降低(P＜0.01)，分別為(9.42±2.90)%和(12.68±3.67)%。吉順榮等[9]報道了52例B細胞胰腺癌患者外周血CD8+CD28+Tc細胞較正常對照組有明顯降低(P＜0.01)，分別為(9.88±4.32)%和(14.12±4.95)%。杜曉輝等[10]報道了胃癌患者外周血CD8+CD28+Tc細胞較健康對照組有明顯降低。本研究中急性白血病初診患者外周血CD8+CD28+Tc細胞表達率為(7.83±4.83)%，較健康對照的組(14.92±4.13)%有明顯減低(P＜0.01)，與上述腫瘤患者的報道相符。提示除了CD8+CD28+Tc細胞在急性白血病患者抗腫瘤效應作用減少，化療后完全緩解患者的CD8+CD28+Tc細胞的表達率較初診患者無明顯變化，可能化療對機體的免疫功能有一定的損傷作用，從而使患者的抗腫瘤作用無明顯增加，因此需要通過免疫調節治療的手段干預患者的CD8+CD28+Tc細胞表達，使其表達上調，從而提高患者的抗腫瘤作用，可能對殺死殘留白血病細胞和減少復發率有一定的作用。

在急性白血病的各分型之間，發現AML、ALL和APL患者外周血CD8+CD28+Tc細胞的表達均低于對照組，存在明顯差異，而AML、ALL與APL患者外周血CD8+CD28+Tc細胞的表達無明顯差別，因標本的數量較少，其關系有待進一步研究。健康個體CD8+CD28+Tc細胞CD8+CD28-Ts細胞的表達率對外周血CD8+T細胞的升高具有相同的功能，然而在一些感染、慢性疾病和腫瘤疾病中并非如此，有的是CD8+CD28+Tc細胞升高而導致CD8+T細胞升高，有的是CD8+CD28-Ts細胞升高而導致CD8+T細胞升高[11]，因此不同的疾病它們之間的關系可能有所不同。本研究發現急性白血病患者外周血CD8+CD28+Tc細胞與CD8+細胞無正相關，因此外周血CD8+T細胞的升高不是由CD8+CD28+Tc細胞的升高而導致，本研究中CD8+CD28+Tc細胞與CD8+T細胞的直線回歸相關系數r=0.098，相關系數顯著性檢驗P＞0.05，差異無統計學意義。

綜上所述，本研究結果表明CD8+CD28+Tc細胞在急性白血病初診患者和化療后完全緩解患者的外周血中表達明顯偏低，抗腫瘤作用減弱，因此需要通過有效的干預患者的免疫功能，提高機體抗腫瘤作用的能力，對提高急性白血病的療效有重要意義。

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Expression of CD8+CD28+Tc cell in the peripheral blood of patients with acute leukemia before and after chemotherapy and its clinical significance.

ZHOU Jing1,CHEN Jian-an1,DING Qian1,HE Yong-ming2,WU Dong-sheng2,CHEN Li-li1.Department of Clinical Laboratory1,Department of Hematology and Oncology2,Donghua Hospital Affiliated to Zhongshan University,Dongguan 523110,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of CD8+CD28+Tc cell in the peripheral blood of patients with acute leukemia before and after chemotherapy and its clinical significance.MethodsThe expression rates of CD8+CD28+Tc cell in peripherical blood were detected by flow cytometry in 40 newly diagnosed patients with acute leukemia(group A),30 patients with complete remission after chemotherapy(group B),and 30 healthy physical examiners(group C).ResultsThe expression rate of CD8+CD28+Tc cell of group A was(7.83±4.83)%,significantly lower than that of group C[(14.92±4.13)%,t=5.68,P＜0.01].The expression rate of CD8+CD28+Tc cell of group B was (8.21±5.68)%,which was significantly lower than that of group C(P＜0.01)and not significantly different from that of group A(P＞0.05).The expression rate of CD8+T cell in group B was significantly higher than that of group A and group C[(43.87±16.47)%vs(31.53±7.25)%and(33.65±7.08)%,P＜0.01].The expression rate of CD8+CD28+Tc cells of acute myelocytic leukemia(AML)and acute lymphoblastic leukemia(ALL)were(7.90±4.63)%and(6.47±2.86)%, significantly lower than those of group C(P＜0.01).The linear regression correlation coefficient(r)between CD8+CD28+Ts cells and CD8+T cells was 0.098,with no statistically significant difference(P＞0.05)and no positive correlation between them.ConclusionThe expressions of CD8+CD28+Tc cells in peripheral blood in newly diagnosed patients with acute leukemia and those in complete remission after chemotherapy are significantly lowered,indicating its decreased anti-tumor ability.To effectively intervene in immunity function of patients and to improve the anti-tumor ability are of great significant to improve the curative effect of acute leukemia.

Acute leukemia;Tumor;Peripheral blood;CD8+CD28+Tc

R733.71

A

1003—6350（2015）12—1778—03

2014-11-22)

東莞市醫療衛生科研計劃項目（編號：20131051010238）

周靜。E-mail：50939593@qq.com

doi∶10.3969/j.issn.1003-6350.2015.12.0636