紅景天苷對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷的神經保護作用

賴文芳，張小琴，洪海棉，謝秀利，洪桂祝

(福建中醫藥大學1.藥學院、2.中西醫結合研究院，福建福州　350122)

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紅景天苷對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷的神經保護作用

賴文芳1，2，張小琴1，洪海棉1，謝秀利1，洪桂祝1

(福建中醫藥大學1.藥學院、2.中西醫結合研究院，福建福州350122)

摘要:目的探討紅景天苷(salidroside，Sal)對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷的神經保護作用及其機制。方法健康成年♂SD大鼠36只，隨機分為3組:假手術組(sham)、模型對照組(MCAO組)、紅景天苷給藥組(MCAO+ Sal組)。通過線栓法制作大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷模型，Longa評分法對大鼠神經功能損傷評分，焦油紫染色法對神經細胞內尼氏(Nissl)小體染色，RT-qPCR技術檢測大鼠缺血側腦組織Neun、Nogo-A與NgR mRNA的表達，Western blot法檢測大鼠缺血側腦組織Bcl-2、Neun、BDNF、NGF、Nogo-A與NgR蛋白的表達。結果與MCAO組比較，紅景天苷能明顯降低神經功能損傷，增加Nissl陽性細胞的數量，促進Bcl-2、Neun、NGF、BDNF的蛋白表達，降低Nogo-A及其受體NgR 的mRNA及蛋白表達。結論紅景天苷能夠降低MCAO模型大鼠神經功能損傷，增加Nissl陽性細胞數目，提高Neun的表達，具有神經保護作用，此作用是通過促進抗凋亡因子Bcl-2及神經營養因子NGF、BDNF的蛋白表達，下調軸突生長抑制因子Nogo-A及其受體NgR的蛋白表達所實現。

關鍵詞:紅景天苷;局灶性腦缺血/再灌注;軸突生長抑制因子;神經生長因子;神經保護;細胞凋亡

腦卒中，俗稱腦中風，是腦血管疾病最嚴重的并發癥。過去的30年，全球共有將近200個治療腦卒中藥物進入臨床試驗，只有組織型纖維蛋白溶活劑(tPA)獲得美國FDA的臨床應用批件。然而，由于tPA只能用于腦血栓病人的缺點，該藥物僅對3%～5%的腦中風病人有治療的效果［1－2］。專家們普遍認為，選擇具有神經保護作用的候選藥物進行研發，可提高腦卒中藥物研發成功的機會［3－4］。

紅景天是景天科紅景天屬植物高山紅景天(Rhodiold rosea L.)的干燥根莖，其性寒、味甘澀，根據中國藥典2010版，紅景天的功能與主治為“益氣活血，通脈平喘。用于氣虛血瘀，胸痹心痛，中風偏癱，倦怠氣喘”。紅景天苷(salidroside，Sal)是紅景天的主要有效成分，在局灶性腦缺血/再灌注大鼠模型中，紅景天苷可減少大鼠局灶性腦缺血/再灌注(MCAO)大腦的梗死體積和降低腦缺血大鼠神經功能缺損評分［5－6］，但其確切機制還不清楚。本研究旨在觀察紅景天苷對MCAO模型大鼠腦組織內抗凋亡基因Bcl-2、神經元特異核蛋白抗原(neuronal nuclei/neuron-specific protein，NeuN)、神經生長因子(nerve growth factor，NGF)、腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)及軸突生長抑制因子(Nogo-A)及其受體NgR mRNA及蛋白表達水平的影響，進一步探討紅景天苷對MCAO模型大鼠神經保護的作用機制。

1　材料

1.1實驗動物健康成年♂，SD大鼠36只，SPF級，體質量260－300g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號: 2007000509960，許可證號: SCXK(滬) 2007－0005，由福建中醫藥大學實驗動物中心飼養。

1.2主要儀器與試劑凝膠成像分析系統(Bio-Rad，型號: ChemiDoc XRS+ )，PCR儀(Bio-Rad，型號: C1000)，熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，型號:7900HT)，高速臺式冷凍離心機(Thermo Fisher，型號: Primo R)。Bcl-2多克隆抗體(Santa Cruz，sc-492)，Neun單克隆抗體(Cell Sigaling，#12943)，NGF多克隆抗體(Santa Cruz，sc-365944)，BDNF多克隆抗體(Santa Cruz，sc-546)，Nogo-A多克隆抗體(Santa Cruz，sc-25660)，NgR多克隆抗體(Santa Cruz，sc-168752)，β-actin抗體(碧云天生物技術研究所，貨號: H015)，RNeasyMini Kit(QIAGEN，貨號:74106)，RT試劑盒(Fermentas，貨號: K1622)，熒光定量PCR Master Mix(Applied Biosystems，貨號: R11022)，PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，參照Gen Bank中大鼠Neun、Nogo-A、NgR、GAPDH mRNA序列，Neun引物上游序列5'-GGGTTTTGGGTTTGTAACTTTTGAA-3';下游序列5'-AGACTGCTCCTACCACAGGGTTTAG-3'，PCR擴增片段長度為188 bp。Nogo-A引物上游序列5'-GGAGAACAACTTGGACGGCTATG-3';下游序列5'-GCATCTCACGCTTGACCCAG-3'，PCR擴增片段長度為128 bp。NgR引物上游序列5'-GATGATGCTCTTAGTGGACCTGTG-3';下游序列5'-CGATACTCAAAAGTCACACGGTTCA-3'，PCR擴增片段長度為129 bp。GAPDH引物上游序列5'-CAACGGGAAACCCATCACCA-3';下游序列5'-ACGCCAGTAGACTCCACGACAT-3'，PCR擴增片段長度為96 bp。紅景天苷由北京大學提供，純度為98%。尼氏(Nissl)染色液(碧云天生物技術研究所，貨號: C0117)。

2　實驗方法

2.1MCAO動物模型制作大鼠經適應性喂養后，腹腔注射10%水合氯醛(3 ml·kg－1體質量)麻醉動物。將甲聚硅氧烷涂層的尼龍單絲從左頸總動脈插入到大腦中動脈的起始端。栓塞后2 h，將尼龍單絲拔出。假手術動物不栓塞中腦動脈。在操作過程中，連續監測動物的溫度，并把溫度保持37℃。參照Longa評定法，進行神經功能損傷程度的評價，3～4級為模型制作成功，可用于實驗。

2.2實驗分組與處理實驗大鼠分為假手術組(sham)，把成模的動物隨機分為模型對照組(MCAO)和紅景天苷給藥組(MCAO+ Sal)，每組12只。MCAO+ Sal組在栓塞2 h后立即腹腔注射紅景天苷(50 mg·kg－1)，連續給藥6 d，于末次給藥4 h后，每組實驗動物斷頭取腦，用于實驗。

2.3評價神經功能損傷參照Longa評定法，每天對大鼠進行神經功能損傷程度的評價: 0級，無缺陷; 1級，不能伸展對側前肢;2級，對側前肢屈曲;3級，輕度向對側轉圈;4級，嚴重的轉圈;5級，對側癱瘓。

2.4Nissl染色腦組織以福爾馬林液固定，充分水洗后，以石蠟包埋，切片厚度為10 μm;將切片脫蠟后至50%酒精內，放入37℃溫箱12 h;切片由酒精中取出，放入0.06%焦油紫液，將切片放置56℃溫箱內染色1 h;用蒸餾水洗去浮色，放入70%酒精分化，至顯微鏡下觀察時見背景無色，細胞及尼氏小體有明顯的輪廓為度;以無水酒精急速脫水5 s，入氯仿5 s，二甲苯透明，香膠封固;尼氏小體呈紫色。

2.5熒光實時定量PCR檢測大鼠腦組織Neun、Nogo-A、NgR mRNA表達按照QIAGEN RNeasyMini Kit試劑盒提取總RNA，用RT逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板，建立qPCR體系為20 μl，反應條件為50℃2 min，95℃預變性10 min，95℃變性15 s，退火60℃30 s，40個循環。

以GAPDH為內參，校正每個樣品的Ct值(每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數)，得ΔCt值。以2－ΔΔCt法計算各組間mRNA的表達量。ΔΔCt=各組(Ct目的基因－CtGAPDH)－對照組(Ct目的基因－CtGAPDH)，2－ΔΔCt=各組基因表達量/對照組基因表達量。

2.6Western blot檢測大鼠腦組織Bcl-2、Neun、NGF、BDNF、Nogo-A、NgR的蛋白表達提取總蛋白，采用SDS-PAGE垂直板全濕法電泳，總蛋白經SDS-PAGE分離后，將凝膠中的蛋白轉移至PVDF膜，用封閉液封閉2 h后加入稀釋的一抗(Bcl-2多克隆抗體1∶600，Neun單克隆抗體1∶500，NGF多克隆抗體1∶1 000，BDNF多克隆抗體1∶1 000，Nogo-A多克隆抗體1∶800，NgR多克隆抗體1∶1 000，β-actin單克隆抗體1∶3 000 )，4℃下孵育過夜，次日TBS洗3遍，每次10 min，加入1∶1 000稀釋HRP標記的第二抗體，室溫下孵育2 h后TBS洗膜。之后加ECL顯色劑經凝膠成像分析系統檢測，分析目標條帶的灰度值，以目標蛋白與β-actin的灰度值比值作為目標蛋白的相對量，并統計各組之間的差異。

2.7統計學分析用SPSS 18.0統計軟件進行分析，數據以±s表示，除了神經損傷評分分析(非參數檢驗，Mann-Whitney test)，其余各組數據間的差別用ANOVA方法分析。

3　結果

3.1紅景天苷對MCAO大鼠神經功能損傷的影響與MCAO組比較，MCAO+ Sal組在d 4開始能夠有效降低神經功能損傷(n=12)，且差異具有顯著性(Fig 1)。

3.2紅景天苷對MCAO大鼠腦組織Nissl陽性細胞數目及bcl-2蛋白表達的影響Nissl染色顯示紅景天苷給藥d 6后，能夠增加Nissl陽性細胞數目，即完整神經細胞的數目(Fig 2) ; Western blot結果表明紅景天苷能夠上調bcl-2的蛋白水平(Fig 3)，這些結果提示著紅景天苷能夠抑制細胞凋亡。

3.3紅景天苷對MCAO大鼠腦組織Neun mRNA及蛋白表達的影響與sham組比較，MCAO組Neun mRNA及蛋白表達明顯降低;與MCAO組比較，紅景天苷給藥d 6后，能夠提高Neun mRNA及蛋白表達，且差異具有顯著性(Fig 4)。

3.4紅景天苷對MCAO大鼠腦組織NGF、BDNF的蛋白表達的影響與sham組比較，MCAO組大鼠腦組織NGF、BDNF的蛋白達明顯降低;與MCAO組比較，紅景天苷給藥d 6后，能夠提高大鼠腦組織NGF、BDNF的蛋白表達，且差異具有顯著性(Fig 5)。

Fig 1 Effects of salidroside treatment on neurologicalscore in MCAO rats(n=12)

Fig 2 Nissl-stained cells in ischemic brain(±s，n=6)

Fig 3 Effects of salidroside treatment on Bcl-2 protein in ischemic brain(n=3)

Fig 4 Effects of salidroside treatment on Neun mRNA (A) and protein (B) in ischemic brain(n=3)

3.5紅景天苷對MCAO大鼠腦組織Nogo-A及其受體NgR mRNA及蛋白表達的影響與sham組比較，MCAO組大鼠腦組織Nogo-A及其受體NgR mRNA及蛋白表達明顯升高;與MCAO組比較，紅景天苷給藥d 6后，能夠降低大鼠腦組織Nogo-A及其受體NgR mRNA及蛋白表達且差異具有顯著性(Fig 6，7)。

4　討論

本研究發現紅景天苷能夠促進MCAO模型大鼠Bcl-2、Neun、NGF、BDNF的蛋白表達水平。Bcl-2是細胞死亡的負調因子，在細胞受到外界刺激時能保護細胞免于凋亡。NeuN是一種穩定而敏感的成熟神經細胞特異抗原的標記物，是神經組織特異的蛋白，參與神經系統的發育、分化和功能，在局灶性腦缺血的研究中應用較多［7］。同時，神經細胞的存活及維持其正常功能依賴于神經營養因子，而NGF，BDNF是神經營養因子家族中的重要成員［8］，NGF是神經營養因子中最早被發現，具有神經細胞營養和促突起生長雙重生物學功能的一種神經細胞生長調節因子，它對中樞及周圍神經細胞的發育、分化、生長、再生和功能特性的表達均具有重要的調控作用; BDNF是在腦內合成的一種蛋白質，它廣泛分布于中樞神經系統內，在中樞神經系統發育過程中，對神經細胞的存活、分化、生長發育起重要作用，并能防止神經細胞受損傷死亡、改善神經細胞的病理狀態、促進受損傷神經細胞再生及分化等生物效應，也是成熟的中樞及周圍神經系統的神經細胞維持生存及正常生理功能所必需。

Fig 5 Effects of salidroside treatment on BDNF(A)，NGF(B) in ischemic brain(n=3)

Fig 6 Effects of salidroside treatment on Nogo-A mRNA (A)and protein (B) in ischemic brain(n=3)

Fig 7　Effects of salidroside treatment on NgR mRNA (A) and protein (B) in ischemic brain(n=3)

腦內促進與抑制神經生長因子共同調控著軸突的生長。Nogo-A是目前已知主要的軸突生長抑制因子，具有最強的抑制神經生長的作用，而Nogo-A受體NgR介導了這一作用［9］。近年來，人們對Nogo-A及其受體NgR的結構及功能進行了大量研究，有了更為深入的了解。有研究表明［10］，調控Nogo-A及其受體NgR可影響腦缺血的發展和結果。本研究發現，紅景天苷能夠抑制Nogo-A及其受體NgR的基因和蛋白表達，改善軸突生長的微環境。

綜上所述，紅景天苷能夠降低MCAO模型大鼠神經功能損傷，增加Nissl陽性細胞數目，提高Neun的表達，具有神經保護作用，此作用是通過促進抗凋亡因子Bcl-2及神經營養因子NGF、BDNF的表達，下調軸突生長抑制因子Nogo-A及其受體NgR的表達所實現。

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Neuroprotective effects of salidroside against focal celebral ischemia/reperfusion injury in rats

LAI Wen-fang1，2，ZHANG Xiao-qin1，HONG Hai-mian1，XIE Xiu-li1，HONG Gui-zhu1
(1.College of Pharmacy，2.Academy of Integrative Medicine，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350122，China)

Abstract:AimTo investigate the effect of Salidroside on the focal celebral ischemia/reperfusion injury in rats and its underlying mechanism.Methods Adult male Sprague-Dawley rats，weighing 260-300 g，were randomly divided into three groups: sham，MCAO，MCAO+ salidroside(Sal) groups.The rats were subjected to local celebral ischemia reperfusion with suture-occluded method.The rats of MCAO+ Sal group were treated intraperitoneally with salidroside (50 mg ·kg(－1)) for 6 days.Neurological deficit testing was performed with Longa’s Scale.The mRNA expressions of Neun，Nogo-A，and NgR were detected by RT-qPCR in ischemic brain.The protein expressions of Neun，NGF，BDNF，Nogo -A and NgR were determined bybook=780,ebook=45Western blot.Results Compared with MCAO group，salidroside significantly improved the neurological deficit，promoted the expressions of Bcl-2，Neun，NGF，BDNF，and inhibited the expressions of Nogo-A，NgR.ConclusionSalidroside can reduce neurological deficit，increase the number of Nissl’s Body and the expression of Neun，and protect rats against focal celebral ischemia/reperfusion injury，which may be accomplished by increasing the expressions of Bcl-2，NGF，BDNF，and inhibiting the expressions of Nogo-A，NgR.

Key words:salidroside; focal celebral ischemia reperfusion; axonal growth inhibitors; nerve growth factor; neuroprotection; apoptosis

作者簡介:賴文芳(1985－)，女，博士生，助理研究員，研究方向:藥理學，E-mail:13559102126@163.com;洪桂祝(1966－)，女，博士，教授，研究方向:心腦血管藥效藥理學，通訊作者，E-mail: guizhuhong@ yahoo.co.uk

基金項目:國家自然科學基金資助課題(No 81473382) ;福建省科技廳重點項目(No 2014Y4004) ;福建省自然科學基金項目(No 2015J01328 ) ;福建中醫藥大學校管課題(No X2013010)

收稿日期:2015－02－08，修回日期:2015－03－07

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978(2015) 06－0775－06中國圖書分類號: R-332; R284.1; R322.81; R743.310.531

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.008