混凝好氧顆粒污泥絮凝劑微生物毒理實(shí)驗(yàn)研究

易 誠，龍九妹，劉 最，彭 鋼

（1.衡陽師范學(xué)院生命科學(xué)系，湖南 衡陽 421008；2.衡陽師范學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)系，湖南 衡陽 421008）

0 引 言

自1991年Mishima等［1］第一次報(bào)道了利用連續(xù)流AUSB反應(yīng)器培養(yǎng)出好氧顆粒污泥以來，好氧顆粒污泥技術(shù)作為一項(xiàng)新型廢水生物處理技術(shù)成為研究的熱點(diǎn)。快速培養(yǎng)好氧顆粒污泥成為好氧顆粒污泥工業(yè)化需要解決的問題，宋雪松等［2－4］通過添加聚合氯化鋁（PAC）、易誠等［5，6］通過利用聚丙烯酰胺（PAM）進(jìn)行混凝強(qiáng)化促進(jìn)好氧顆粒污泥形成的研究。使絮凝劑毒性成為被關(guān)注的問題，發(fā)光細(xì)菌毒性試驗(yàn)具有快速、直觀、全面的特點(diǎn)，其具有試驗(yàn)費(fèi)用低、毒性效應(yīng)明顯、試驗(yàn)周期短等優(yōu)點(diǎn)，從而被廣泛應(yīng)用于水質(zhì)綜合毒性檢測(cè)中［7－8］。為選擇混凝效果良好絮凝劑，本團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了混凝好氧顆粒污泥絮凝劑的選擇研究［9］，選擇常用的PAM、PAC（聚合氯化鋁）及殼聚糖為絮凝劑，為保證絮凝劑對(duì)微生物安全有效，本研究利用發(fā)光菌檢測(cè)法（GB／T15441－1995）進(jìn)行絮凝劑微生物毒理實(shí)驗(yàn)研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 試劑與材料

（1）實(shí)驗(yàn)菌種：湖南省環(huán)境監(jiān)測(cè)站提供的明亮發(fā)光桿菌T3小種凍干菌粉（800萬Cell／g）。

（2）聚炳烯酰胺（分析純，分子量在400－500萬）濃度為弱陰離子型聚丙烯酰胺（PAM）。

（3）聚合氯化鋁，Al2O3含量33.32%，鹽基度83.66%。

殼聚糖（食品級(jí)，脫乙酰度為85%，黏度為800，分子量在100萬左右）。

（4）培養(yǎng)基：胰蛋白胨5.0g，酵母膏5.0g，NaCl 30.0g，KH2PO41.0g，Na2HPO45.0g，甘油3.0g，加蒸餾水定容至1000ml，調(diào)節(jié)pH7.0±0.5，制成液體培養(yǎng)基。在液體培養(yǎng)基中加入瓊脂169g，制成固體培養(yǎng)基。

（5）稀釋液 根據(jù)要求使用3%NaCl溶液和2%NaCl溶液。

（6）儀器與器材

生物發(fā)光光度計(jì)、比色管、恒溫振蕩器、培養(yǎng)箱、手提式高壓消毒鍋、移液器、容量瓶、三角瓶等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)光菌復(fù)活

冷藏的發(fā)光菌凍干粉，加入冷的2%NaCl溶液0.5ml，置冰浴中，充分搖勻，復(fù)蘇2min，使其初始發(fā)光量在600－1900mv之間［10］。

取不同濃度待測(cè)液2mL入磨口比色管，每濃度設(shè)3管重復(fù)，以2mL NaCl（3%）溶液作對(duì)照（CK）。取培養(yǎng)好的菌液2mL用NaCl（3%）溶液適當(dāng)稀釋，充O2振蕩均勻后取2mL入各比色管中，加塞搖勻后去塞，15min后檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度，每濃度取平均值［11］。

1.2.2 樣品液制備

樣品制備條件的確定 樣品的毒性，與其含量、固有毒性及在溶液中分散程度等有關(guān)，還與懸浮液的制備條件有關(guān)［12］。以濃度為10000mg／L 的PAM溶液對(duì)明亮發(fā)光桿菌T3進(jìn)行2組懸浮液制備條件的平行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)液制備條件的主要因素包括攪拌時(shí)間、攪拌速度及靜置時(shí)間，經(jīng)毒性實(shí)驗(yàn)確定樣品液制備的條件為：攪拌速度300 r／min、攪拌時(shí)間為10min、靜置時(shí)間為10min。

樣品制備 將待測(cè)樣與3%NaCl溶液以1∶9（體積比）混合，在300r／min條件下攪拌10min，后再靜置10min后，取混懸液中層部分并稀釋成濃度不同的懸浮液樣品。

1.2.3 HgC12標(biāo)準(zhǔn)曲線制作［11］

用3%NaCl作稀釋液，配制2mg／L HgCl2溶液，用50ml容量瓶稀釋成0.04mg／L、0.08mg／L、0.12mg／L、0.16mg／L、0.20mg／L、0.24mg／L。HgCl2溶液各濃度設(shè)3個(gè)平行，每溶液瓶中各加2m1已培養(yǎng)好的菌液，同時(shí)在3個(gè)對(duì)應(yīng)平行對(duì)照（ck）加3%NaC1 2m1。

相對(duì)發(fā)光度是由HgCl2各濃度與相對(duì)應(yīng)（ck）測(cè)得發(fā)光量相比求出的平均值。

建立HgCl2濃度（c）與相對(duì)發(fā)光度（T）的相關(guān)方程：T＝a＋bcHgC12，并通過查相關(guān)系數(shù)顯著水平（P值表），檢驗(yàn)所求值的顯著水平P＜0.01，說明EC50HgCl2＝0.10±0.02mg／L所求的方程成立，反之，不成立。

1.2.4 樣品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)

每個(gè)樣品設(shè)平行3個(gè)測(cè)試瓶。每瓶加2m1培養(yǎng)好的菌液的，每個(gè)樣品設(shè)對(duì)應(yīng)3個(gè)平行對(duì)照（ck），每個(gè)對(duì)照瓶加3%NaCl溶液2ml.

根據(jù)HgCl2工作曲線測(cè)定的方法進(jìn)行測(cè)定相對(duì)發(fā)光度，對(duì)計(jì)算結(jié)果利用origin7.5軟件進(jìn)行線性擬合，建立并檢驗(yàn)各試驗(yàn)濃度（（c）與相對(duì)發(fā)光度（T）的相關(guān)方程：T＝a＋bc，根據(jù)方程求出EC50值［13］，根據(jù)EC50值判斷樣品的毒性。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)方法準(zhǔn)確性驗(yàn)證

根據(jù)測(cè)定的相對(duì)發(fā)光度制作HgCl2工作曲線，建立并檢驗(yàn)各試驗(yàn)濃度（（c）與相對(duì)發(fā)光度（T）的相關(guān)方程：T＝a＋bc，根據(jù)方程求出EC50值，見圖1。

圖1 T3菌發(fā)光度的Hg Cl2檢測(cè)曲線Fig.1Hg curve of T3bacteria luminosity

從測(cè)試結(jié)果來看，HgCl2濃度系列通過建立相關(guān)方程及相關(guān)性顯著性檢驗(yàn)，P＝0.0024，明顯小于0.01，表明其非常顯著的相關(guān)性，相關(guān)方程成立。且 15min－EC50HgCl2值基本保持在 0.10±0.02mg／L范圍內(nèi)，符合方法的兩項(xiàng)指標(biāo)要求，說明本次發(fā)光菌測(cè)試結(jié)果是準(zhǔn)確可信的。在測(cè)定中，我們注意到發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度在反應(yīng)前1min有所上升，可能是反應(yīng)初始菌液瞬時(shí)被稀釋而使發(fā)生強(qiáng)度有所升高。然后在HgCl2毒性作用下，發(fā)光菌發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間而不斷下降，2—5min范圍內(nèi)降幅較小，每1min降幅值約為初始值的2%，且逐漸增加；在6—13min范圍內(nèi)降幅最大，每1min降幅可達(dá)初始值的5%，后期降幅減少；在14—17min范圍內(nèi)，降幅與2—5min范圍內(nèi)的降幅相似；18—23min范圍內(nèi)降速變得更緩慢，30min后趨于平穩(wěn)。這可能是因?yàn)镠gCl2毒性使細(xì)菌熒光素酶失活，從而抑制了細(xì)菌細(xì)胞發(fā)光反應(yīng)，造成發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，但在此毒性濃度內(nèi)，對(duì)細(xì)菌不會(huì)致死，而細(xì)胞通過 “應(yīng)激”作用而使發(fā)光強(qiáng)度降速逐漸減緩［14］，實(shí)驗(yàn)與文獻(xiàn)［15］結(jié)果較為吻合。

2.2 聚合氯化鋁對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度的影響

通過實(shí)驗(yàn)建立T3菌發(fā)光度與PAC相關(guān)曲線如圖2，檢驗(yàn)各試驗(yàn)濃度（（c）與相對(duì)發(fā)光度（T）的相關(guān)方程：T＝a＋bc，P＜0.001，表明其非常顯著的相關(guān)性，相關(guān)方程成立。在實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)聚合氯化鋁濃度為1000—2000mg／L時(shí)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度保持在97%—99%間，對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度無多大影響。當(dāng)聚合氯化鋁濃度達(dá)4000mg／L時(shí)，對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度產(chǎn)生顯著影響，且發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度隨聚合氯化鋁濃度的升高而逐漸減弱，測(cè)定其相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度降低50%時(shí)，聚合氯化鋁的15min－EC50值為10200mg／L，與文獻(xiàn)［16］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為接近。

圖2 T3菌發(fā)光度與PAC相關(guān)曲線Fig.2T3bacteria luminosity curve with the PAC

2.3 聚丙烯酰胺對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度的影響

通過實(shí)驗(yàn)建立T3菌發(fā)光度與PAM相關(guān)曲線如圖3，檢驗(yàn)各試驗(yàn)濃度（（c）與相對(duì)發(fā)光度（T）的相關(guān)方程：T＝a＋bc，P＜0.001，表明其非常顯著的相關(guān)性，相關(guān)方程成立。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺濃度為2000—4000mg／L時(shí)其相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度變化很小，均保持在96%以上，當(dāng)聚丙烯酰胺濃度6000mg／L時(shí)對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度產(chǎn)生比較顯著的影響，且發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度隨聚丙烯酰胺濃度的升高而逐漸減弱，這可能與聚丙烯酰胺的性質(zhì)有關(guān)，本身是非危險(xiǎn)品，無毒、無味、無腐蝕性，但可能與其在水中降解產(chǎn)生單體丙烯酰胺（AM），而單體的丙烯酰胺具有很大毒性，會(huì)對(duì)人和動(dòng)物周圍神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生永久的、不可修復(fù)的損害［17］，聚丙烯酰胺濃度較低時(shí)，丙烯酰胺單體成分少，不至于對(duì)發(fā)光菌產(chǎn)生影響，但隨聚丙烯酰胺濃度的升高，其單體成分增加，對(duì)發(fā)光細(xì)菌的影響也就越大。測(cè)定其相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度降低50% 時(shí)，聚丙烯酰胺的 15min－EC50值為17200mg／L。

圖3 T3菌發(fā)光度與PAM相關(guān)曲線Fig.3T3bacteria luminosity curve with the PAM

2.4 殼聚糖對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度的影響

通過實(shí)驗(yàn)建立T3菌發(fā)光度與殼聚糖相關(guān)曲線如圖4，檢驗(yàn)各試驗(yàn)濃度（（c）與相對(duì)發(fā)光度（T）的相關(guān)方程：T＝a＋bc，P＜0.001，表明其非常顯著的相關(guān)性，相關(guān)方程成立。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)殼聚糖濃度為40000—80000mg／L時(shí)其相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度變化很小，均保持在98%以上，實(shí)驗(yàn)測(cè)定其相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度降低50%時(shí)，聚丙烯酰胺的 15min－EC50值 為169400mg／L。

圖4 T3菌發(fā)光度與殼聚糖相關(guān)曲線Fig.4 T3bacteria luminosity curve with chitosan

在殼聚糖相對(duì)發(fā)光度的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)了殼聚糖的相對(duì)發(fā)光度大于1，說明了殼聚糖對(duì)發(fā)光細(xì)菌具有一定的活化作用，與文獻(xiàn)［18］研究相同。但實(shí)驗(yàn)表明，其相對(duì)發(fā)光度與其濃度間呈現(xiàn)一定的負(fù)相關(guān)性，說明殼聚糖對(duì)發(fā)光細(xì)菌同時(shí)具有一定的毒性作用，且其毒性因素隨樣品濃度的增大而增加，其毒性或許與純度、濃度、操作及發(fā)光菌自身因素等有一定的關(guān)系，其毒性的影響有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)去探討。但對(duì)于做為絮凝劑來說，其使用量能保證安全的需要。

3 結(jié) 論

通過毒性 （MTX）實(shí)驗(yàn)表明：聚合氯化鋁的15min－EC50值（細(xì)菌發(fā)光半數(shù)抑制劑量）為10200mg／L，聚丙烯酰胺的 15min－EC50值 為17200mg／L、殼聚糖的15min－EC50值為169400mg／L。由于在水處理中，聚合氯化鋁、聚丙烯酰胺、殼聚糖使用的濃度較低下，其在水溶液中所形成的濃度不足以對(duì)發(fā)光細(xì)菌產(chǎn)生毒性效應(yīng)，因此三種絮凝劑均可以用于混凝好氧顆粒污泥培養(yǎng)的應(yīng)用。

［1］Mishima K，Nakamura M.Self－immobilization of aerobic activated sludge a pilot study of the process in municipal sewage treatment［J］.Water Sci Technol.；1991，23（4）：981－990

［2］宋雪松，劉永軍，劉 喆，等.混凝強(qiáng)化形成好氧顆粒污泥［J］.環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2014，8（3）：929－934

［3］徐紅霞，劉永軍，宋雪松，等.混凝強(qiáng)化造粒條件下好氧顆粒污泥的去污特性［J］.安全與環(huán)境，2014，14（1）：182－186

［4］張馳，劉永軍，劉喆，等.混凝強(qiáng)化造粒條件下好氧顆粒污泥中微生物的繁衍與聚集［J］.水土保持學(xué)報(bào)，2013，27（5）：214－218

［5］易誠，湛含輝，陳津端，等.攪拌－序批式活性污泥反應(yīng)器（WSBR）中好氧顆粒污泥的特性研究［J］.環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31（2）：268－275

［6］易誠，湛含輝，陳津端，等.WSBR培養(yǎng)好氧顆粒污泥的試驗(yàn)研究［J］.中國礦業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，41（2）：327－333

［7］吳泳標(biāo)，張國霞，許玫英，等.發(fā)光細(xì)菌在水環(huán)境生物毒性檢測(cè)中應(yīng)用的研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2010，37（8）：1222－1226

［8］朱麗娜，劉瑞志，夏建新，等.發(fā)光細(xì)菌法測(cè)定水質(zhì)綜合毒性研究進(jìn)展［J］.中央民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，20（4）：14－20

［9］易誠，湛含輝，程勝高.混凝好氧顆粒污泥的絮凝劑選擇［J］.環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2014，8（10）：4097－4013

［10］國家環(huán)境保護(hù)總局，國家技術(shù)監(jiān)督局.水質(zhì)急性毒性的測(cè)定發(fā)光細(xì)菌法［M］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1996：1－7

［11］馬文猗 ，楊柳燕.環(huán)境微生物工程［M］.南京：南京大學(xué)出版社，1998：104－108

［12］李秀珍，李斌蓮，范俊欣，等.油田化學(xué)劑和鉆井液生物毒性檢測(cè)新方法及毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.鉆井液與完井液，2004，21（6）：44－46，82

［13］農(nóng)永光，胡剛.發(fā)光細(xì)菌法在國內(nèi)水質(zhì)監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用［J］.分析儀器，2012（1）：79－81

［14］黃正，汪亞洲，王家玲.細(xì)菌發(fā)光傳感器在快速檢測(cè)污染物急性毒性中的應(yīng)用［J］.環(huán)境科學(xué)，1997，18（4）：14－17

［15］張金麗，袁建軍，鄭天凌，等.Microtox技術(shù)檢測(cè)多環(huán)芳烴生物毒性的研究［J］.中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2004，12（4）：68－71

［16］丘豐，胡怡秀，臧雪冰，等.三種凈水劑的毒性研究［J］.實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，1999，6（4）：316

［17］Sathesh C P，Thatheyus A J.Biodegradation of acrylamide employing free and immobilized cells of Pseudomonas aeruginosa［J］.International Biodeterioration ＆Biodegradation，2007，60：69－73

［18］田昆侖，李東紅，劉良明，等.殼聚糖及其水溶性衍生物的細(xì)胞毒性研究［J］.現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)生物工程學(xué)雜志，2002，8（6）：422－423，426