農桿菌介導的植物遺傳轉化影響因素研究進展

孫華軍等

（1.內蒙古民族大學生命科學學院，內蒙古通遼 028000；2.內蒙古自治區高校蓖麻產業研究中心，內蒙古通遼 028000；3.通遼市土肥料工作站，內蒙古通遼 028000；4.通遼市農業科學研究院，內蒙古通遼 028000）

摘要農桿菌介導的轉基因方法與其他方法相比具有較多優點，已被廣泛應用于植物遺傳轉化研究。目前對其轉化機理的研究已經相當深入，而對影響因素的研究較少。主要對農桿菌介導的遺傳轉化影響因素進行詳細評述，對其作用機理及應用前景進行了說明并進行展望，以期為提高植物轉基因效率研究提供理論依據。

關鍵詞農桿菌；遺傳轉化；影響因素

中圖分類號S188文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2015）24-026-02

植物轉基因方法有很多種，如農桿菌介導法、基因槍法、超聲波法、電轉化法和花粉管通道法等，其中基因槍法和農桿菌介導法是目前最常用的植物轉基因方法。與基因槍法相比，農桿菌介導法具有操作簡單、費用低、轉化率高和轉化機理清楚等優點，已成為目前植物轉基因的首選方法。

農桿菌屬于革蘭氏陰性土壤桿菌，可以分為兩類。一類是能使被侵染植物細胞誘發冠癭瘤的根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens），其含有Ti質粒；另一類是能導致被侵染植物細胞產生毛發狀根的發根農桿菌（Agrobacterium rhizogenes），其含有Ri質粒。Ti質粒和Ri質粒上都有一段轉移DNA（transfer DNA，又稱 TDNA），受傷的雙子葉植物細胞分泌的酚類化合物、中性糖等可使農桿菌吸附在植物上，攜帶了目的基因的TDNA進入植物細胞，從而使目的基因整合到植物基因組中。利用農桿菌介導法已經實現了多種植物材料的遺傳轉化，得到了大量具有優良性狀的品種。目前對農桿菌介導遺傳轉化作用機理的研究比較透徹，對其影響因素及應用研究卻較少。筆者論述了農桿菌介導遺傳轉化的影響因素，并對其作用機理和應用進行闡述，并提出問題和展望。

1農桿菌介導的遺傳轉化作用機理

農桿菌攜帶的遺傳組分TDNA區和毒性vir區是植物遺傳轉化所必需的。TDNA區域兩端是2個約25 bp的正向重復序列，分別稱為左邊界（left border）和右邊界（right border），是決定TDNA在Ti質粒上特定位置的唯一順式作用元件。目的基因處于左右邊界之間，TDNA區域最終被整合到植物基因組中使其攜帶的基因在植物中得以表達。農桿菌介導遺傳轉化過程是在Ti質粒攜帶的毒性基因輔助下完成， Ti質粒vir毒性區包括8個操縱子virA、virB、virC、virD、virE、virF、virG和virH，他們編碼大部分能將TDNA運輸和整合到宿主基因組中的毒性蛋白質。它們中的任何一個發生突變都不會發生轉化。此外，根癌農桿菌基因組中chvA、chvB、chvD、att等毒性基因在根癌農桿菌介導植物遺傳轉化中能識別宿主細胞發出的信號，并使毒性蛋白對此作出響應。受傷的雙子葉植物細胞分泌的大量酚類化合物、中性糖如乙酰丁香酮（AS）和羥基乙酰丁香酮（ HOAS）等既是根癌農桿菌的趨化物，又是農桿菌中毒性基因Vir表達的誘導物，在它們的作用下，促進TDNA的加工、轉移和整合，從而侵染植物細胞。帶有傷口的單子葉植物細胞不會分泌有利的酚類化合物和中性糖，所以在轉化過程中人為添加AS可以促進根癌農桿菌感染單子葉植物。

2影響農桿菌介導的遺傳轉化因素

TDNA轉移和整合到植物基因組中受農桿菌和植物組織特異性因素影響。Guo等就農桿菌介導番茄遺傳轉化的影響因素進行了廣泛研究，結果表明，轉化效率與侵染時間、細菌懸浮液濃度以及共培養時間有關。一些物種如甘蔗、玉米、小麥和大豆經蔗糖脫水處理后TDNA的傳遞效率顯著提升。

2.1外植體類型

外植體類型是轉化的主要影響因素。不同來源和發育狀態的受體都會對農桿菌的侵染產生很大影響。外植體的類型有很多種，如根、莖、子葉、芽、胚胎等，其分生組織細胞完成轉基因后必須能從轉化處理造成的沖擊恢復并快速再生植株，根據試驗目的及意義選擇合適的材料作為外植體至關重要。風信子和水仙的葉片已成功地作為外植體進行轉化。幼齡外植體如未成熟胚比成熟外植體更利于進行轉化。與雙子葉植物相比，單子葉植物對農桿菌的敏感性差，部分單子葉植物進行遺傳轉化時加入適量AS可明顯提高轉化效率。

2.2細菌菌株

所用細菌菌株的類型會影響轉化效率。常用菌株有LBA4404、EHA105和GV3101等。Sheetal等分析了LBA4404、EHA105和GV3101 3種菌株對農桿菌介導假馬齒莧遺傳轉化的影響，結果表明LBA4404轉化效率最高，EHA105次之。對毛果楊與美洲黑楊雜交種以及美洲黑楊與歐洲黑楊雜交種的研究表明，EHA105菌株優于C58和LBA4404菌株。

2.3培養基組成

培養基組成包括鹽濃度、糖含量、生長調節劑和一些化學物質的加入等，也對轉化效率有巨大影響。目前已發現9種能模仿天然酚類化合物誘導農桿菌vir區基因活化并促使TDNA形成從而增強轉化效率的物質，其中AS和羥基乙酰丁香酮（OHAS）的作用較強，在較低濃度時仍可促使農桿菌整合到植物細胞中。在某些植物中也檢測到能影響植物遺傳轉化和再生的其他化學成分，如二硫蘇糖醇、硫代硫酸鈉和L半胱氨酸，它們與潮霉素B結合提高了大豆轉基因的頻率。此外，由于氯化鉀和稀土元素鈰和鑭的鹽能夠明顯改善植物生長狀況，從而對提高根癌農桿菌介導的植物遺傳轉化效率有顯著的積極作用。消毒煙草葉片和莖提取物比乙酰丁香酮更能有效地提高玉米轉化效率，此提取物的刺激作用是由于煙草中含有大量能誘導TDNA轉移的有利酚類化合物、糖和氨基酸等。相信煙草提取物可同樣有利于單子葉觀賞植物的改造。

2.4共培養時間及溫度

用處于對數生長期的農桿菌侵染外植體并進行共培養使農桿菌將外源基因整合到植物基因組中是提高農桿菌介導遺傳轉化效率的有效方法之一。由于來自根癌農桿菌的TDNA轉移到植物基因組中多發生在細胞周期的S期，所以必須建立最佳共培養時間。外植體與農桿菌的共培養時間可能有1～5 d的變化，時間太短轉化效率低，時間太長會導致農桿菌過度生長。對于大多數植物物種而言，48～72 h共培養時間最為理想。百子蓮共培養時間的研究發現2～3 d共培養時間最佳，1 d時農桿菌不能很好地進入植物細胞轉化效率降低，而時間過長會導致農桿菌過度生長為抑菌工作帶來困難。共培養溫度對轉化有較大影響，19～20 ℃是雙子葉植物高效轉化的最適溫度，單子葉植物最佳共培養溫度為24～25 ℃。在“南林楊895”的抗蟲轉化試驗中發現最佳共培養溫度為28 ℃。由此可知，在植物遺傳轉化中最佳共培養時間和溫度是提高轉化效率的關鍵。

2.5農桿菌濃度及侵染時間

共培養過程中細菌所處狀態和濃度對轉化效率有很大影響，合適的菌液濃度和侵染時間是提高植物遺傳轉化效率的關鍵。Sana等對農桿菌介導的丁香羅勒遺傳轉化研究表明，農桿菌OD600為0.6時轉化效率最佳，過高或過低轉化效率明顯降低。以毛新楊×毛白楊雜種為材料發現當菌液OD600為0.2或0.4侵染時間10～20 min時產生的卡那霉素抗性芽較多。農桿菌濃度超過1010cfu/ml且侵染時間過長時通常會損害植物細胞，并導致細胞恢復能力下降從而降低了穩定轉化效率。

2.6篩選標記基因

篩選標記基因可使轉化細胞帶有除草劑或抗生素抗性，通常與目的基因一起轉化到植物細胞以區分轉化和非轉化外植體。常用的篩選標記基因有新霉素磷酸轉移酶基因nptII、潮霉素磷酸轉移酶基因hpt、雙丙氨酰磷抗性基因bar等。其中使用較普遍的是nptII基因，其編碼新霉素磷酸轉移酶，使細胞具有抗卡那霉素（kanamycin）的能力。研究發現使用卡那霉素作為轉基因楊樹的抗性進行篩選時經常出現嵌合體植株。然而考慮到生物安全問題，有必要開發無篩選標記轉基因植物的新技術。

2.7其他影響因素

2.7.1抑菌抗生素。

侵染完成后帶有農桿菌的外植體培養若干天后會出現連片農桿菌，此時應在培養基中加入適量除菌抗生素如頭孢噻肟、羧芐青霉素等。這些抗生素通過抑制農桿菌過度生長來提高轉化效率，盡管在某些情況下這些因素可能對植物的生長和轉化效率產生不利影響。使用濃度200 mg/L的頭孢霉素對農桿菌侵染后的南林895楊進行處理既不會影響葉盤的分化效率，又能有效抑制農桿菌的生長。青海青楊葉片在侵染農桿菌4 d內向培養基中加入400 mg/L羧芐青霉素，可以有效地抑制農桿菌的過度繁殖，對外植體正常生長影響較小。

2.7.2表面活性劑。

表面活性劑如Silwet L77、吐溫20和聚醚酸F68等具有增強細胞通透性的作用，使農桿菌易于粘附在植物細胞表面或通過消除抑制附著的某些物質，從而提高轉化效率。擬南芥花序侵染時表面活性劑有利于將農桿菌細胞運送到植物組織中去。

3農桿菌介導的遺傳轉化應用

遺傳轉化是植物分子育種的關鍵技術，主要目的是將目的基因導入現有基因組中產生具有優良性狀的物種，同時保持植物的遺傳特性。農桿菌介導的遺傳轉化已被用于生產各種有用蛋白質如重組抗體和可食用疫苗等。轉基因馬鈴薯能表達來自大腸桿菌的不耐熱腸毒素、諾瓦克病毒衣殼蛋白和乙肝表面抗原，轉基因苜蓿能夠表達口蹄疫病毒蛋白，這說明口服免疫的生產已經實現。以植物為材料，利用農桿菌介導的遺傳轉化技術生產出多種救生生物藥物，如抗凝血劑、人表皮生長因子和干擾素等。

3.1生物監測與解毒

有些植物已被設計成生物修復和監控儀，用來檢測環境中有毒化合物的存在并對污染土壤和地表水進行解毒。在擬南芥、印度芥菜和煙草植物中通過超表達能夠誘導植物形成螯合肽的基因提高了植物對金屬的耐受能力。已經開發出能夠將高毒性污染物甲基汞轉換為有更少汞毒元素的轉基因擬南芥植物。通過農桿菌介導的遺傳轉化技術對印度芥菜進行改造實現了煉油廠廢水中常見污染物亞硒酸鈉的合理處理。Hannink等對煙草進行定向改造以促進炸藥中三硝基甲苯的降解。而且，通過將參與谷胱甘肽生物合成酶的表達與參與砷代謝酶的表達結合實現了對砷耐受并有高積累量轉基因植物的形成。

3.2提高作物產量

農桿菌介導遺傳轉化的應用已經使作物產量顯著提升。在水稻密植條件下對油菜素內酯合成相關基因進行調控，結果發現其產量有顯著性變化，并研究出油菜素內酯含量極高的水稻品種。通過操縱促進熟化激素乙烯的生物合成使“Flavr SAVR”西紅柿實現了貯藏期和藤壽命延長等特性。農桿菌介導的遺傳轉化增強了水稻鐵螯合劑的生物合成，這使得在可用性鐵較低的條件下植物生長和子粒產量得到改善。Kakkar等通過引進各種毒素基因包括最常見的Bt毒素基因到玉米、棉花、馬鈴薯、煙草、水稻等作物中已生產出抗蟲作物。抗菌肽在轉基因擬南芥和馬鈴薯植物中的異位表達為植株提供了強有力的細菌和真菌病原體抗性。

3.3提高作物營養價值

對糧食作物的遺傳修飾為改善和提高食品營養成分提供可能。農桿菌介導遺傳轉化已經用

于提高作物營養價值的幾個方面，包括提高油菜、大豆和玉米中β胡蘿卜素含量；改善油料作物油成分和含量；減少水稻中維生素A缺乏癥并開發“金稻”。將水仙中番茄紅素合成酶基因轉移到玉米中，發現玉米中β胡蘿卜素水平顯著提升。在西紅柿中超表達其他有效抗氧化劑如番茄紅素和綠原酸相關基因，西紅柿抗氧化能力增強。然而盡管農桿菌介導的遺傳轉化在植物基因工程中已有顯著成效，有些問題還需要解決。

4展望

目前農桿菌介導遺傳轉化技術已成為提高農產品產量以滿足世界人口不斷增加需求的有效方法。隨著農桿菌高效遺傳轉化的不斷更新和發展，全世界對作物遺傳改良作出了巨大努力，使農桿菌介導的遺傳轉化技術為人類解決更多生產和生活中的問題，為推動經濟發展提供強大動力。目前對于農桿菌介導的遺傳轉化需要解決的重點及難點問題之一是轉化效率較低，這是以后研究中應解決的首要問題，而無選擇標記轉基因植物的生產也是目前植物分子生物學和生物技術領域急于解決的問題之一。

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