酶聯免疫吸附試驗（ELISA）注意事項

摘 要：本文主要探討了酶聯免疫吸附試驗（ELISA）中常見的影響因素，對學生實驗中常出現的問題進行原因分析，并總結解決辦法。ELISA試驗操作中的各個環節對試驗的檢測效果影響較大，有可能導致顯色不全、假陰性或假陽性結果。

關鍵詞：酶聯免疫;吸附試驗;滿版

實驗室常用固相酶免疫測定方法在1971年最初建立，稱為酶聯免疫吸附測定（Enzyme linked immunsorbent assay），簡稱ELISA。原理為抗原抗體特異性結合和抗原抗體的酶標記，以酶催化底物顯色來判斷結果。

影響酶聯免疫測定的因素較多，如標本的采集保存、試劑的準備、加樣的技術、溫度的控制、洗滌反應板的方式、顯色反應時間的控制等，均可能對試驗結果產生很大影響。只有避免這些因素，才能保證試驗結果的準確性和可靠性。

一、移液槍的使用

我院免疫實驗室常用手動單道移液器。注意事項：（1）吸樣前要保證槍頭和液體處于相同溫度;（2）若容量瓶中的液體太少，可倒入ep管中，方便吸取;（3）嚴格精確調節方法;（4）安裝槍頭要垂直插入，左右輕微轉動上緊，上下敲擊會引起內部的零部件因瞬間強烈撞擊而松散;（5）垂直吸液，槍頭吸嘴尖端需浸入液面2～4mm以下，一般液體，正向吸液1～2檔，粘稠液可反向吸液2～1檔，緩慢吸取，控制好彈簧的伸縮速度，太快會產生反沖和氣泡，吸取后將移液槍提離液面，停頓1秒鐘，觀察是否有液滴流出，若有流出，說明有漏氣現象;（6）放液時將吸嘴貼到容器內壁并保持10～400傾斜，平穩把按鈕壓到1檔，停約一秒鐘到2檔，排出剩余液體。

吸取液體時一定要緩慢平穩地松開拇指，不能突然松開，以防溶液吸入過快而沖入槍體內腐蝕柱塞造成漏氣。

移液槍應輕拿輕放，不能將已吸有液體的移液槍平放或倒置。

不要將按鈕旋轉出量程，否則會卡住內部機修裝置而損壞;長時間不用時建議將刻度調至最大量程，讓彈簧恢復原形，可延長使用壽命;定期對移液槍校準。

二、加樣

加樣不可太快，要避免加在孔壁上部。不可濺出和產生氣泡，如有氣泡，抗原抗體不能有效地結合會導致弱陽性甚至假陰性。

三、溫育

ELISA屬于固相免疫測定，抗原和抗體必須在一定溫度條件下反應一定的時間，微孔板從室溫至恒溫箱升至37℃，也需要一定時間。而在臨床實驗中很少人注意這個問題，通常以放入溫箱即開始計時，這樣弱陽性樣本測不出來，為避免蒸發，板上應封蓋。

四、洗版

在實驗室中，ELISA測定的洗版一般有兩種方式，即手工和洗板機洗版，用洗板機洗版結果準確可靠。

五、顯色

一般顯色反應條件為37或室溫反應15～30分鐘。在一定時間內，陰性孔可保持無色，而陽性孔隨時間的延長而呈色加強，加TMB作用后，2小時可完全消退至無色。

六、比色

ELISA比色用酶標儀進行，應注意：

酶標儀不應放置在強光照射下，使用前先預熱15～30分鐘。波長是否已調至合適或所用濾光片是否正確，通常我們在軟件選項中選擇雙波長比色，它是在敏感波長450nm和非敏感波長630nm下兩次吸光度的差值。

七、ELISA實際操作中常見問題和解決辦法

1.顯色淡，靈敏度低

實驗前試劑盒至于室溫30分鐘以上，保溫期內不宜多開門。換用合格的蒸餾水，不要使用過期試劑。

2.滿版白，陽性對照不顯色

嚴格按照試劑說明書操作，加液時看準標簽。選用潔凈量筒，正確稀釋洗滌液，不要漏加試劑。

3.滿板顯色

顯色時應避免保溫，調準培養箱溫度。樣品應新鮮，長期保存在-20℃冷凍保存。防止污染，孵育時貼封片或加蓋，洗滌要充分。

八、結論

酶聯免疫吸附試驗以靈敏度高、特異性好等特點，在臨床上得到了廣泛應用，嚴謹的設計、優質的試劑、良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結果準確可靠的必要條件，嚴格遵照規定操作，必能得出準確的結果。

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