DNA甲基化在法醫學組織/體液來源鑒定中的研究現狀

摘 要：犯罪現場遺留的組織/體液的來源鑒定對案件的性質、偵破有著極其重要的作用。在法醫物證組織/體液來源鑒定中最常見、最經典的方法是根據組織/體液中所含有的特殊蛋白質或酶分子，從而確定其組織/體液的來源。近年來也有學者根據不同體液和組織間的特異性表達，利用mRNA或micro RNA來進行組織體液鑒定。但以上的方法仍存在著一些局限性，蛋白質/酶、RNA的穩定性差，易受環境因素的影響，另外還需消耗額外樣本，故對陳舊、腐敗樣本及微量物證檢材不適用。隨著現代表觀遺傳學的發展，人們發現哺乳動物基因組中存在組織特異性差異甲基化區域，這為利用DNA甲基化進行組織/體液來源鑒定提供了理論依據。

關鍵詞：組織/體液鑒定；DNA甲基化；CpG島；tDMRs

犯罪現場遺留的各種生物性檢材對案件性質有著極為重要的作用，特定組織/體液的存在可能與某種特定類型的犯罪有關，因此正確識別現場物證的組織/體液來源有助于推斷案件性質。組織/體液來源鑒定方法中最常見、最經典的方法是根據組織/體液中所含有的特殊蛋白質或酶分子，通過酶促反應或免疫學檢測方法來檢測這些特定的蛋白質，從而篩選和確認各種體液和組織來源。雖然，這些傳統的鑒定方法對少數組織/體液具有較高的準確性，但仍存在一定的缺陷，傳統方法檢測過后的檢材不能繼續用于后繼的DNA分析，并且消耗檢材量大，故對量少的檢材極為不利；此外，蛋白質易受環境因素的破壞，不如DNA穩定，致使對陳舊或腐敗降解的檢材檢測困難。此外，根據mRNA檢測鑒定體液來源。人體體細胞擁有個體的全部遺傳信息，但人體里不同類型的組織/細胞因生理功能差異其信使核糖核酸（mRNA）亦不相同。因此，我們可利用各類型細胞內不同mRNA表達譜進行體液或組織特異性檢測。但因mRNARNA是單鏈結構，易被核糖核酸酶所降解，不如DNA穩定，因此對陳舊或腐敗降解的樣本不適用。

近年來，全基因組表觀遺傳學的研究表明[1]，哺乳動物基因組中存在組織特異性差異甲基化區域（tissue specific differentially methylated regions， tDMRs），即在不同類型的細胞或組織中表現出特異性DNA甲基化模式。故組織/體液中特定的DNA甲基化模式可能是一個有前途的組織體液鑒定的指標，這為利用DNA甲基化進行組織/體液鑒定提供了理論依據。

一、DNA甲基化

DNA甲基化是表觀遺傳學的重要組成部分，是DNA堿基復制后的共價修飾。在人類基因組中，5’-CpG-3’二核苷酸是DNA甲基化發生的主要位點，被修飾的堿基主要是CpG二核苷酸中胞嘧啶環的第五號位碳原子上，形成5’-甲基胞嘧啶（5-methycytosine，5-mC）[2]。DNA甲基化是在DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferases， DNMTs）催化作用下，把S-腺苷酰-L-甲硫氨酰（SAM）的甲基（-CH3）選擇性共價添加到胞嘧啶上[3]。在哺乳動物全基因組中[1]，大約70%-80%的CpG是處于甲基化狀態的，而未發生甲基化的CpG二核苷酸位點則主要密集分布于基因的啟動子區域和第一個外顯子區域，被稱為CpG島（CpG island），在基因表達的調控和基因和基因突變上都可能發揮著重要作用。

全基因組表觀遺傳學分析發現，不同組織在染色體特定位置上存在組織特異性差異甲基化區域，在不同組織/體液中表現出特異性DNA甲基化模式。因此，在法醫學領域中，DNA甲基化提出了作為一種新的分子標記來區別組織/體液。

二、國內外DNA甲基化在組織/體液來源鑒定中的研究現狀

1.國內法醫體液鑒定的研究現狀

目前我國已有學者開始嘗試利用DNA甲基化對常見法醫檢材進行組織/體液來源鑒定。2005年，趙貴森等首次提出了根據DNA甲基化進行法醫組織來源鑒別的思路。范光耀等[4]（2009）采用聯合亞硫酸氫鹽的限制酶法（combined bisulfite restriction analysis，COBRA），研究法醫學常見體液中的DNA甲基化水平，結果發現大腦組織、精液組織分別在GFAP和DDX4基因的啟動子區表現為特異性低甲基化，可有效區別腦組織、精液斑組織與其他組織。馬麗莉等[5]（2013）采用MS-RDA（甲基化敏感性代表性差異分析法）技術對全基因組中的DNA甲基化位點進行篩查得出，血液、肌肉和其他組織存在甲基化差異的候選靶片段，為應用DNA甲基化進行組織/體液鑒定提供部分候選位點，也進一步驗證了DNA甲基化可以應用于人體組織/體液鑒定。

2.國外法醫體液鑒定的研究現狀

在法醫學領域中，Frumkin[6]（2011）等是首個探索應用DNA甲基化鑒定組織/體液來源的可能性。Frumkin等對法醫實踐中常見體液進行核酸限制性內切酶（methylation-sensitive restriction enzyme）酶切消化，并對人類基因組CpG島中的205個包含HhaI酶切位點（-GCGC-）的基因序列進行甲基化分析，得出38個位點表現出顯著差異擴增模式，其中成功篩選出15個具有組織差異性的甲基化位點，最終確定7個位點能有效地區別外周血、精液、唾液和皮膚上皮組織，這為法醫組織/體液來源鑒定提供了新方向。隨后，Wasserstrom[7]等在該研究方法的基礎上，新開發了一種試劑盒—DSI-SemenTM，該試劑盒包含8個基因位點，3個控制位點，5個具有差異甲基化的特殊基因位點，能有效的區別精液成分與非精液成分。Lee等采用亞硫酸氫鹽轉化后克隆測序的方法，對法醫常見體液的5個tDMRs（DACT1、USP49、HOXA4、PFN3和PRMT2）進行DNA甲基化水平分析，發現不同的組織/體液其甲基化水平不同，進一步顯示了DNA甲基化的組織/體液的鑒定潛力。Madi等采用亞硫酸氫鹽聯合焦磷酸測序技術對C20orf117、ZC3H12D、BCAS4和FGF7中的多個CpG位點進行定量檢測，最后得出每個位點中的CpG甲基化程度以及其相應的甲基化百分比。2013年，J H An等[8]引用以前報道中tDMRs，建立了兩種不同的復合擴增系統來分析這幾個基因座上CpG位點的甲基化水平。這兩種擴增方法分別使用了甲基化敏感性限制酶PCR（MSRE-PCR）和甲基化單堿基延伸反應擴增（SNaPshot），此兩種方法均能成功鑒別出精液和精子細胞，并能從血液和唾液中區分出月經血和陰道分泌液。K Balamurugan等在以往報道的DACT1、USP49、ZC3H12D和DDX4的基礎上，又添加另外兩個標記（Hs-INSL6和B-SPTB-03），研究表明這六個標記均能成功地把精液與其他四個組織類型區分開來，進一步驗證了DNA甲基化作為法醫組織標記的可行性。JLPark等[9]使用Illumina公司人類甲基化450k珠數組篩查發現8個CpG位點作為新的法醫相關的DNA甲基化標記性。以上研究報道的體液特異性DNA甲基化標記在唾液和陰道分泌液中DNA甲基化差異性較低。A Choi等[10]聯合應用DNA甲基化和體液特異性微生物DNA。在該研究中，A Choi等添加一個精液特異性標記和唾液、陰道分泌液特異性細菌16 sRNA基因，來提高檢測體液特定類型的功效。

三、DNA甲基化應用于人體組織/體液鑒定的可能影響因素

雖然不同的組織間存在不同的DNA甲基化模式，這為DNA甲基化應用于人體組織/體液鑒定提供了依據，但機體的DNA甲基化水平仍受到各種因素的因素，這對DNA甲基化在組織/體液來源鑒定中有一定的影響。（下轉第282頁）

（上接第280頁）

首先，大量研究發現，DNA甲基化水平與飲食、藥物等外界環境因素直接相關。如葉酸是合成S-腺苷蛋氨酸（SAM）的前提物質，故機體內葉酸或維生素B缺乏可引起DNA 甲基化的異常。其次，醫學研究發現，基因組中絕大多數位點的甲基化狀態是穩定的，然而，這種穩定的甲基化模式在腫瘤細胞中發生改變。再者，DNA甲基化水平與個體年齡有一定的相關性。國內外大量的研究表明，基因組DNA甲基化總體水平隨著年齡的增長而不斷的下降。JLPark等在研究中發現，血液中的CpG位點PRMT2就是一個與年齡增長相關的體液特異性DNA甲基化的位點[9]。還有，有時同種組織或同種細胞在不同個體中，其DNA甲基化模式也存在一定的差異。有關同卵雙生子（monozygotic twins，MZ）的最新研究成果表明，雖然MZ具有完全相同的基因組序列，但由于胚胎期子宮的特征和成長過程中的環境因素影響，MZ之間存在DNA甲基化修飾差異。最后，DNA甲基化水平與性別也存在一定的差異。Lee等在研究中發現HOXA4基因位點上的DNA甲基化水平在男性與女性的唾液中差異顯著，男性、女性唾液的甲基化水平分別是52.3%、90.7%。

四、展望

目前DNA甲基化在組織/體液鑒定中的應用仍處于初步階段，現在研究中所選擇的組織特異性差異甲基化位點數量有限，卻大多數位點僅對精斑檢材具有較強的特異性，這還無法滿足法醫實踐中有效地鑒別多種不同組織/體液來源的需要。因此，只有通過不斷的研究，篩選出更多組織特異性差異DNA甲基化位點，選用合適、有效的方法，才能為法醫學組織/體液來源鑒定打下基礎。

參考文獻：

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