高效液相色譜法測定蕎麥中蘆丁含量

穆志新 ，田 翔 ，周建萍 ，師 穎

（1.山西省農業科學院農作物品種資源研究所，農業部黃土高原作物基因與種質創制重點實驗室，雜糧種質資源發掘與遺傳改良山西省重點實驗室，山西太原030031；2.山西省農業科學院農產品質量安全與檢測研究所，山西太原030031）

蕎麥最早起源于我國，栽培歷史悠久，種植經驗也很豐富。蕎麥味道清香，在日本、朝鮮、韓國以及我國的東北、華北等地區都是很受歡迎的食品[1-2]。蕎麥是一種獨特的藥食兩用作物，其營養價值和藥用價值豐富。利用蕎米和蕎麥面粉直接加工可以制作成面條、烙餅、涼粉、灌腸等地方特色小吃。蕎麥性甘味涼，含有非常豐富的天然生物活性成分黃酮類物質——蘆丁。蘆丁又稱維生素P，屬于維生素類藥，能夠有效地降低毛細血管的通透性和脆性，從而保持和恢復毛細血管的正常彈性；還可用于防治高血壓、腦溢血、糖尿病、視網膜出血和出血性紫癜等，也可用作食品抗氧化劑和色素。此外，蘆丁還是心腦血管用藥合成曲克蘆丁的主要原料，而曲克蘆丁能有效地抑制血小板的聚集，防止血栓的形成。

蕎麥中蘆丁含量的高低影響著蕎麥的品質。因此，本試驗研究一種檢測蕎麥中蘆丁含量的有效方法[3-4]，旨在為進一步選育高蘆丁含量的蕎麥品種以及將其用于醫藥工業奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 樣品

供試苦蕎樣品由山西省農業科學院農作物品種資源研究所蕎麥課題組育種專家提供。

1.2 儀器與試劑

Agilent1200高效液相色譜儀，美國安捷倫科技；AS10200AT超聲波清洗器，天津奧特賽恩斯；BSA2202S分析天平，德國賽多利斯；Eppendorf5804R高速離心機，德國艾本德股份公司；DirectQ-3超純水機，美國Millipole；DHG-9140AS電熱鼓風干燥箱，寧波東南儀器有限公司。

甲醇色譜純：Fisher Scientific；標準品蘆丁（純度98%）：Sigma；磷酸二氫鉀優級純：國藥集團；水為超純水。

1.3 色譜條件

安捷倫 C18柱（4.6mm×150 mm，5μm），柱溫為30℃，甲醇∶0.5%磷酸（V/V）＝40∶60作為流動相，流速為1mL/min，進樣量是5μL，檢測波長為204 nm。

1.4 標準工作曲線

精密稱取干燥的蘆丁標準品10mg，加入甲醇定容至10mL，制成質量濃度為1mg/mL的儲備液[5]。再將標準品稀釋成 50，100，200，300，400μg/mL的質量濃度梯度。圖1為蘆丁標準品的高效液相色譜圖，保留時間為3.475min[6-8]。

1.5 樣品處理

取樣10 g，置于40℃烘干箱中鼓風干燥4 h，立即放入旋風磨中粉碎，并全部通過0.177mm篩，備用。取制備好的試樣0.10 g于2mL離心管中，加1mL甲醇振蕩混勻，水溫60℃超聲萃取1 h，再以4 000 r/min的速度離心10 min，收集上清液，重復2次，并將2次提取液合并到25mL容量瓶中，用0.1mol/L磷酸調pH值至6左右，定容。過0.22μm有機濾膜備用[9-10]。

2 結果與分析

2.1 校準曲線的繪制與樣品測定[11-13]

取1.4配制的系列標準混合工作溶液，質量濃度按從低到高順序分別進樣5μL，以標準工作溶液質量濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制校準曲線。同時取萃取好的待測樣液過濾后進樣5μL，記錄峰面積。從工作曲線上查出待測各組分的質量濃度，根據稀釋倍數，計算被測樣品中各組分的百分含量。結果表明，蘆丁標準品含量在50.0～400.0μg/mL范圍內呈線性關系（圖2），按照標準品質量濃度（x）與對應的色譜峰面積（y）得到線性方程：y＝10.946x－247.2（R2＝0.999 7）。

2.2 樣品含量測定

按照1.5的方法處理蕎麥樣品，并且按照1.3的色譜條件進行分析，記錄峰面積。根據濃度、稀釋倍數以及樣品的重復，計算得出蕎麥中的蘆丁含量?？梢愿鶕嗍w蘆丁含量篩選出蘆丁高含量苦蕎種質資源[14]（表1）。圖3為蕎麥樣品蘆丁含量色譜圖。

表1 24份核心種質資源蘆丁含量

2.3 方法的精密度和回收率測定

稱取0.1 g的蘆丁質量分數為20.5mg/kg的蕎麥樣品6份，分別按照3個質量分數水平50，80，100mg/kg加入標準溶液，按本試驗方法進行提取和測定（每個添加水平平行測定6次），計算平均加標回收率和相對標準偏差[15]。從表2可以看出，平均加標回收率介于97.2%～104.1%之間，相對標準偏差介于1.8%～2.3%之間，說明該方法準確、穩定、可靠。

表2 精密度和回收率測定結果

2.4 穩定性試驗

12 h內每隔2 h對蕎麥進樣一次，記錄峰面積，結果顯示，供試樣品峰面積的相對標準偏差為2.1%，表明樣品的穩定性較好。

3 討論

之前的研究往往采用60%～70%的乙醇或甲醇提取蕎麥中的蘆丁。在本試驗中，采用流動相甲醇來提取蕎麥中的蘆丁，相比于用乙醇提取蘆丁，該方法提取樣品的穩定性以及試驗的重復性都更好。在用高效液相色譜法檢測蘆丁的含量時，主要是通過控制流動相比例及檢測波長來優化試驗條件[16]。近年來，隨著生活水平的不斷提高，人們越來越注重食品的功能性，即食品的保健作用，作物育種工作的熱點也隨之向功能育種轉變。種質資源是育種工作的物質基礎，同樣功能育種也需要發掘特異性狀優良的種質。對所搜集的核心種質進行蘆丁含量測定，篩選出蘆丁高含量和高產量的蕎麥種質，以期為蕎麥功能育種提供依據。

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