晚期糖化終產物受體中和抗體緩解腰5脊神經結扎大鼠神經病理性疼痛的效果觀察

李向南，李永華，袁紅斌

神經病理性疼痛是一種常見的難治性疼痛，指原發或繼發于神經系統損害、功能障礙所導致的疼痛。創傷、手術、糖尿病及感染常導致神經病理性疼痛的發生，而臨床上有效的治療辦法并不多。衛星膠質細胞(sate11ite g1ia1 ce11s，SGCs)作為背根神經節(DRG)中圍繞感覺神經元的膠質細胞，其神經免疫功能受到疼痛學研究的普遍重視。目前認為，外周神經損傷后，激活的衛星膠質細胞介導啟動了一系列免疫炎癥反應，分泌包括腫瘤壞死因子α(TNF－α)在內的一系列促炎細胞因子，介導感覺神經元的痛覺過敏［1］。晚期糖化終產物受體(recepotr for advanced g1ycation end products，RAGE)，是一種細胞膜表面免疫球蛋白超家族蛋白受體，廣泛分布，其下游NF－κB入核調節炎癥因子的釋放［2］。本研究旨在觀察抑制炎癥因子的上游RAGE中和抗體是否對腰5脊神經結扎大鼠神經病理性疼痛的緩解有更好的效果，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組 雄性SD大鼠，體質量200～250 g，由第二軍醫大學實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK(滬)2007－0003。篩選基礎痛閾值在10～18 g之間的大鼠，分為3組:(1)對照組10只，暴露左側L5脊神經，但不結扎，注射生理鹽水。(2)安慰劑組10只，暴露左側L5脊神經并結扎，術后鞘內注射生理鹽水。(3)藥物組10只，暴露左側L5脊神經并結扎，手術后鞘內注射RAGE中和抗體5 μg/d，至術后第7天。各實驗組大鼠采用低劑量(約 10 μ1)緩慢注射(3.3 μ1/min)的方法以保證注射藥物擴散在大鼠腰5脊神經。實驗中SD大鼠在標準條件下飼養，自由攝取水和食物，手術前6 h禁食禁飲。

1.2 方法

1.2.1 鞘內置管 于大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉20 mg/kg，消毒后，沿脊椎中線切開皮膚，找到 L5、L6棘突根部縫隙，用小針刺破，將PE－10導管內充滿生理鹽水后，從縫隙中插入髓鞘內約1.5 cm。導管從皮下沿脊柱向上在大鼠頸部穿出固定，封閉導管，消毒分層縫合肌肉及皮膚。以大鼠鞘內注射10 μ1利多卡因后后腳明顯出現癱軟，30 min內恢復反應作為手術成功的標準。置管成功后單籠飼養。

1.2.2 動物模型建立 將置管成功的大鼠，參考Kim等［7］方法建立大鼠腰 5神經根結扎(SNL)模型。大鼠麻醉后，于大鼠L4～S2棘突水平沿背部皮膚作縱向中線切口，分離肌肉至第5腰椎橫突，切斷橫突暴露第5腰神經，用5－0絲線結扎神經，縫合皮膚與肌肉，避免術后感染。對照組僅暴露但不結扎L5神經，其余步驟相同。

1.2.3 免疫組化熒光染色 采用數字表法隨機選取正常大鼠和SNL后大鼠各4只麻醉后灌流固定，取術側L5和L4背根神經節，放入4%PFA固定4～6 h，然后用20%蔗糖/PBS溶液脫水2 d。將組織包埋15 μm切片，貼片在92.5℃的水浴抗原修復10 min。0.01 mo1/L PBS漂洗3次，每次5 min。貼片滴加羊抗RAGE多克隆一抗(1∶100)，室溫孵育16～18 h，0.01 mo1/L PBS 漂洗3 次，每次5 min，然后加Cy3－驢抗羊 IgG 二抗(1∶400)，0.01 mo1/L PBS漂洗3次，每次5 min，加甘油分封片。在熒光顯微鏡下觀察并拍照(×400)。

1.2.4 測定機械縮爪閾值和熱刺激縮爪潛伏期分別于手術前1 d、手術后第1、3、5、7天測定大鼠機械縮爪閾值(paw withdraw1 thresho1d，PWT)和熱刺激縮爪潛伏期(paw therma1 withdraw 1atency，PT－WL)。測定前將大鼠置于有機玻璃箱內適應15 min后，用von Frey纖毛絲自金屬網下部垂直刺激大鼠后肢足底中部，持續時間≤4 s，大鼠出現縮足或舔足行為視為陽性反應，否則為陰性反應。測定首先從2 g刺激開始，如該力度的刺激不能引起陽性反應，則給予相鄰大一級力度的刺激;如出現陽性反應則給予相鄰小一級力度的刺激。如此連續進行，直至出現第一次陽性和陰性反應的騎跨，再連續測定4次。最大力度為15 g，大于此值時記為15 g。每次刺激間隔30 s。用熱板法測定各組大鼠熱刺激縮爪潛伏期。將大鼠放入熱板痛覺測痛儀上。待大鼠在透明的玻璃箱內安靜后，開啟電源輻射刺激足底。當大鼠出現逃避性抬腿或者舔足時，立刻切斷熱源，記錄開始照射至出現縮足逃避反射時間(s)，照射截止時間為20 s，以防大鼠足底灼傷。每只大鼠重復3次，取平均值即為PTWL。

1.2.5 ELISA測定 將大鼠麻醉后，在生理鹽水冰面上迅速分取L5背根神經節，勻漿粉碎組織后加入組織裂解液，0℃靜置30 min，以12 000 r/min低溫離心5 min后，采用BCA法測定蛋白含量。采用雙抗體夾心ABC－ELISA法檢測TNF－α和白細胞介素(IL)－1β。將酶標包被板分別設置標準孔、待測孔和空白對照孔，將標準液和樣本分別加入相應孔中37℃孵育1 h，洗滌;加入新鮮稀釋的酶標第二抗體37℃孵育40 min，洗滌，加入底物 OPD，顯色，在492 nm處測光密度值，通過繪制標準曲線求出標本的 TNF－α、IL－1β 水平。

1.3 統計學處理 數據使用SPSS 18.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析(one－way ANOVA)，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 動物模型建立 L5 SNL術后大鼠出現術側后足不愿著地、足底外翻等典型機械痛敏體征，機械縮爪反射閾值呈逐步下降，說明制作的SNL模型是成功的。

2.2 SNL術后RAGE表達量變化 圖1 A、B、C分別表示大鼠正常背根神經節、SNL術后L5背根神經節、SNL術后L4背根神經節。可見SNL術后RAGE平均熒光強度為(42.80±4.19)，比術前(19.78±4.19)表達水平增高(P＜0.05)，而L4背根神經節并無明顯變化。結果提示，SNL術后RAGE在神經病理性痛疼的發生中可能發揮重要作用。

圖1 RAGE在SNL前后表達變化免疫組化圖

2.3 行為學研究結果 SNL術后，L5背根神經節RAGE平均熒光強度(42.80±4.19)比術前(19.78±4.19)增高，差異有統計學意義(P＜0.05)。安慰劑組大鼠術后1、3、5、7 d機械縮爪閾值(9.30±2.10，4.60±1.35，3.80 ±1.4，3.60 ±1.26)與對照組(13.00±2.58，12.50±2.64，13.50 ±2.42，13.00±2.58)比較差異有統計學意義(P＜0.05)。安慰劑組大鼠術后1、3、5、7 d熱刺激縮爪潛伏期(10.01±1.16，5.40+1.50，4.32 ±1.16，4.40 ±1.43)與對照組(12.80±1.14，13.00±1.25，12.70 ±1.34，12.80±1.55)比較差異有統計學意義(P＜0.05)。藥物組大鼠術后3、5、7 d機械縮爪閾值(8.00±2.31，7.40±2.12，7.20 ±1.93)與安慰劑組(4.60±1.35，3.80±1.40，3.60 ±1.26)比較差異有統計學意義(P＜0.05)。藥物組大鼠術后3、5、7 d熱刺激縮爪潛伏期(8.15±1.37，8.26±1.29，7.00±1.07)與安慰劑組(5.40±1.51，4.32±1.16，4.40±1.43)比較差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖2。

2.4 各組大鼠TNF－α和IL－1β的表達變化 為了確定RAGE中和抗體發揮鎮痛作用的機制，筆者通過ELISA檢測了其下游促炎細胞因子TNF－α和IL－1β的表達情況。藥物組大鼠術后L5背根神經節TNF－α表達量(70.53±6.57)與安慰劑組(109.90±4.97)比較差異有統計學意義(P＜0.05)。藥物組大鼠術后L5背根神經節IL－1β表達量(88.24±3.60)與安慰劑組(168.77±6.34)比較差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖3。

圖2 各組大鼠不同時間點機械縮爪閾值與熱刺激縮爪潛伏期

3 討論

RAGE作為細胞膜表面免疫球蛋白超家族蛋白受體，具有多種配體，包括HMGB1 S100/鈣結合蛋白、淀粉樣多肽［3］。在生理狀態下呈低水平表達，當細胞處于激活或應激狀態時，受損細胞中RAGE的表達增多。RAGE與配體結合后激活細胞內各種信號轉導機制，其中最重要的是氧化應激反應的增加和免疫炎性反應的加劇，最終產生致病效應。RAGE與不同配體結合后，可以激活細胞內不同的信號傳導通路，比如 Ras－ERK、p38－MAPK 和 cdc42/rac途徑，其多種信號通路大部分可通過NF－κB調節基因轉錄。NF－κB的激活可引起靶細胞產生大量的促炎因子，加劇炎癥反應［4］。而外周神經組織損傷后，作為外周傳入中樞信號換元的重要結構，背根神經節的功能異常對痛覺異常和痛覺過敏具有關鍵作用。衛星膠質細胞圍繞感覺神經元，由縫隙連接相連，包繞感覺神經元構成了一個感覺神經元的微環境，一方面調節神經元的功能，另一方面其穩定性也受神經元的影響。筆者的研究發現RAGE在L5脊神經結扎后的DRG組織中表達增加，印證了Shibasaki等研究結果，根據其研究報道，RAGE在SNL模型建立后脊髓背角的表達沒有顯著差異［5］。

圖3 各組大鼠背根神經節中TNF-α和IL-1β的表達情況

外周神經損傷后，衛星膠質細胞的功能和狀態發生改變。激活的衛星膠質細胞增殖并啟動了一系列免疫炎癥反應，介導DRG感覺神經元的痛覺過敏，在這個過程中釋放大量的促炎癥因子。以往的研究中發現，腫瘤壞死因子α是神經系統較早釋放的促炎細胞因子之一，其受體TNFR在毗鄰損傷的外周神經元上表達上調［3］，提示TNF－α可能在神經病理性疼痛的形成和發展中發揮重要的作用。炎癥因子一方面作用于神經元，通過膠質神經元交互作用改變神經元的敏感性，另一方面又可自分泌作用于SGCs，形成正反饋，使pERK水平長時間增高，進一步增加其下游NF－κB表達入核促炎因子的釋放，加劇疼痛狀態的維持等［6］。雖然干預TNF－α的信號通路可以改善外周神經損傷導致的痛覺過敏，但臨床上通過干預炎癥因子的方法治療疼痛存在治療時間窗短，療效差等問題［7］。筆者的研究將炎癥因子的上游調節蛋白RAGE作為靶點，采用鞘內給予RAGE中和抗體而阻斷RAGE信號傳導能夠扭轉周圍神經損傷后導致的痛覺過敏，可能是通過抑制衛星膠質細胞的活化減少了TNF－α和IL－1β生成。

綜上所述，外周神經損傷可引起RAGE在背根神經節的表達增高，而鞘內注射RAGE中和抗體，可以減少TNF－α和IL－1β的表達并且改善SNL后大鼠痛閾值。鑒于RAGE對神經病理性疼痛發揮的作用，干預其信號通路傳導對治療神經病理性疼痛的具有良好的前景。

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