Jagged1蛋白在早期自然流產患者絨毛組織中表達的研究

王晨曦，林其德

導致自然流產的根本原因之一可能是滋養細胞的缺血、缺氧及血管重鑄障礙。筆者在前期研究中發現，母胎界面Notch受體(Notch1－4)的異常表達可能誘導自然流產的發生［1－2］。Notch1/Jagged1 在晚期妊娠子癇前期胎盤組織中表達下調［3］，可能在早期就影響滋養細胞的分化、浸潤、絨毛胎盤的血管形成，故本研究進一步檢測了Jagged1在早期自然流產患者絨毛組織中的表達，以了解Jagged1蛋白是否參與自然流產的發生發展過程。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2011年12月至2013年2月在解放軍第四一一醫院計劃生育門診就診的患者，經患者知情同意及醫院倫理委員會同意行絨毛標本采集。15例自然流產患者為自然流產組，平均年齡(28.2±1.93)歲，平均孕周(7.06±1.58)周，B超顯示無胚芽或無胎心搏動伴陰道流血;20例正常早期妊娠患者為正常妊娠組，自愿要求中止妊娠，平均年齡(26.12±2.58)歲，平均孕周(7.03±1.02)周，B超顯示有胚胎心血管博動，無不良妊娠史。2組患者的年齡和孕周比較差異均無統計學差異(P＞0.05)。

1.2 方法 (1)標本采集:無菌采集上述2組的離體絨毛，PBS洗凈血液，一半用4%多聚甲醛固定24～48 h后，常規石蠟包埋;另一半放入焦炭酸二乙酯(DEPC)處理的冷凍管中，置－80℃冰箱保存，用于RNA抽提和蛋白質提取。(2)引物與探針:根據Gene Bank提供的Jagged1和GAPDH基因mRNA序列，采用ABI Primer 5.0軟件設計引物和TAMRA探針，由上海英駿生物技術有限公司和上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列見文獻［3］。(3)實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(rea1－time RT－PCR):按照RNA抽提試劑盒和cDNA逆轉錄試劑盒(購自Invitrogen和Toyobo Biotech公司)說明進行 RNA抽提和 cDNA合成［3］。(4)免疫印跡法檢測(Western－b1ot):取凍存管中絨毛組織約100 mg，加入 200 ～1 000 μ1總蛋白抽提液，嚴格按照蛋白免疫印跡操作步驟進行。使用標準曲線計算未知樣品蛋白的相對含量［3］。

1.3 統計學處理 采用SPSS 10.0統計軟件，結果以均數±標準差(x±s)表示，組間差異比較采用F檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 自然流產組與正常妊娠組絨毛Jagged1蛋白的免疫定位 妊娠早期Jagged1蛋白主要在細胞滋養細胞的細胞漿中表達。在自然流產組絨毛組織中呈弱陽性表達，較正常妊娠組略減弱。見圖1。

注:A為正常妊娠組;B為自然流產組

1 2組患者絨毛組織Jagged1蛋白的免疫定位(HE染色)

2.2 自然流產組與正常妊娠組絨毛Jagged1mRNA的表達 Rea1－time PCR結果以2－ΔΔCt比值來表示。正常妊娠組絨毛組織中 Jagged1mRNA的2－ΔΔCt水平為(0.0623±0.0007)，明顯高于自然流產組的(0.0315±0.0065)，約為自然流產組的1.97倍，差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.3 自然流產組與正常妊娠組絨毛Jagged1蛋白的表達 2組絨毛組織中Jagged1蛋白的表達，以目的蛋白條帶與β－actin條帶吸光度相對比值表示樣本的相對含量。Western－b1ot分析顯示，正常妊娠組絨毛組織中Jagged1表達水平為0.67±0.24，自然流產組為0.59±0.18，2組差異無統計學意義(P＞0.05)。

3 討論

妊娠早期滋養細胞適時、適量增殖、分化、遷移、浸潤、凋亡是胚胎著床和胎盤形成的關鍵，母胎界面滋養細胞浸潤子宮內膜的過程類似于惡性腫瘤的侵襲，這一過程受滋養細胞和局部微環境的精細調節，從而達到動態平衡。Notch受體或配體蛋白的激活可能啟動滋養細胞和血管內皮細胞之間的“對話”，促母胎界面新生血管形成。Notch受體與鄰近細胞表面的配體結合后，可激活Notch信號通路。在大多數對惡性腫瘤的研究［4－6］中都表現為 Notch受體和配體分子表達失調以及Notch信號的異常激活。Jagged1參與調控許多組織的生長發育，在造血、肌肉形成、神經和血管發生等過程中起重要作用。研究顯示［7－8］，Jagged1 在腫瘤組織中多呈高表達，提示與惡性腫瘤侵襲性增強、預后不良有關，可作為腫瘤侵襲、轉移的重要指標。

Jagged1是哺乳動物組織中第一個被證實的Notch受體的配體，通過與鄰近細胞表面Notch的細胞外結構域結合而觸發Notch信號通路，為單次跨膜糖蛋白，屬于 DSL(De1ta，Serrate，Lag－2)蛋白家族，胞外區具有2個保守序列，即1個富含半胱氨酸的區域(systeine－rich，CR)也就是結合Notch受體所必需的DSL基序，和16個表皮生長因子(epiderma1 growth factor，EGF)樣重復區。人類Jagged1基因定位于染色體20p12，全長5.94 kb，ORF編碼3 657個氨基酸，與大鼠Jagged1的胞外區有98%的同源性。在早期胚胎發育的血管形成中，Notch基因起著關鍵性的作用，Jagged1可引發附近血管細胞中Notch的活化并促進新生血管的形成，可能作為癌基因影響細胞的浸潤能力和抑制新生血管的發生［9－10］。小鼠Jagged1突變引起血管發育缺陷，導致胚胎死亡［11］。在臨床中可見，部分自然流產患者B超提示在胚囊或胚芽階段缺乏心管搏動出現胚胎停育，或者胚胎心管搏動從有到無，提示胚胎早期血供不足或心血管發育障礙是自然流產的病因之一。Herr［12］的研究結果顯示，Jagged1在人類胎盤血管形成和分化過程中起潛在的關鍵性的作用。

Notch蛋白的調控異常可能造成母胎界面滋養細胞促血管樣結構形成能力的受限。筆者的前期研究［1－3］結果提示，Notch 蛋白可能由于其配體和受體在母胎界面表達的異常，直接影響滋養細胞的遷移和浸潤功能，阻礙了母胎界面新生血管的形成，可造成病理妊娠的發生。本研究結果顯示Jagged1蛋白在自然流產絨毛組織中的表達呈下調趨勢，提示Jagged1可能與血管形成障礙(血管生成減少或血管穩定性差)有關，從而造成滋養細胞和胎盤組織缺血缺氧，誘導并參與了自然流產的發生發展過程。

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