利用Gateway技術改造原核表達載體pGEX—4T—1、pET—28a

胡麗松 鄔華松 郝朝運 譚樂和 范睿 吳剛

摘 ?要 ?質粒載體是基因工程研究中不可或缺的工具。為提高載體構建效率，進一步滿足基因工程研究在構建表達載體時的需要，本文提供了一種重組型載體的改造策略。基本流程如下：利用帶BglⅡ、XhoⅠ酶切位點以及attB重組序列的引物，從Gateway的入門載體pDONR Zeo中克隆到“BglⅡ-attB1-ccdB-attB2-XhoⅠ”片段。通過酶切連接的方法，將該片段插入到原核表達載體pGEX-4T-1以及pET-28a的多克隆位點，構建具有重組位點以及ccdB致死基因的原核表達載體。以胡椒High mobility group protein（HMGB）基因的開放讀碼框為目標片段，通過重組反應將目的基因構建到改造后的原核表達載體上，經檢測體外誘導表達出大小正確的HMGB蛋白，驗證本研究中改造載體的正確性。該載體的成功構建，為基因工程科研工作提供了一個高效的蛋白表達載體以及載體改造的新策略。

關鍵詞 ?Gateway技術;載體改造;胡椒PnHMGB;原核表達

中圖分類號 ?Q936 ? ? ? ? ?文獻標識碼 ?A

Modification of Prokaryotic Expression Vector

pGEX-4T-1， pET-28a by Using

Gateway Technology

HU Lisong1，2， WU Huasong1，2 *， HAO Chaoyun1，2， TAN Lehe1，2， FAN Rui1，2， WU Gang1，2

1 Spice and Beverage Research Institute，CATAS， Wanning， Hainan 571533， China

2 Ministry of Agriculture Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops / Hainan Provincial

Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulatioin for Tropical Spice and Beverage Crops，

Wanning， Hainan 571533， China

Abstract ?Plasmid vector is a necessary tools for gene engineering. In order to improve the efficiency of vector construction， a strategy for recombinant vector modification was presented. The process as follows： A“BglⅡ-attB1-ccdB-attB2-XhoⅠ”sequence was cloned with 5`-BglⅡ-attB1 and 3`-XhoⅠ-attB2 extension primers from Gateway entry vector pDONR Zeo. Then the sequence was inserted into the multiple cloning site of pGEX-4T-1 and pET-28a to construct the new recombinant ccdB-selection E. coli expression vector. The open read frame（ORF）sequence of PnHMGB was cloned to the new pGEX-4T-1 and pET-28a vector by recombinant reaction. The results of PnHMGB expression in vitro verifies the correctness of vector modification. The successful vector modification supply an efficient E. coli expression vector and a new strategy for recombinant vector modification.

Key words ?Gateway technology; Vector modification; PnHMGB; Prokaryotic expression

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.08.014

天然質粒是存在于受體細胞染色體外的一種裸露的小型環狀雙鏈DNA分子，廣泛存在于細菌、霉菌、藍藻、酵母等細胞，是寄主染色體以外的非必要組成部分，隨著細胞的自我復制而分配到后代中。質粒還具有DNA轉移性，能夠使遺傳物質從一細胞轉移到另一細胞中。這些特點很好的符合了基因工程的研究需要，以質粒為骨架構建而成的載體統稱為質粒載體[1]。目前構建的質粒載體有上百種，廣泛應用的包括pCAMBIA系列真核表達載體，pET系列原核表達載體，pGEM-T克隆載體等[2]。

在質粒載體的基本元件中，有一段包含多個限制性酶切位點的DNA短序列，這一片段稱為多克隆位點（multiple cloning site，MCS）或多位點接頭（polylinker）。該元件是外源遺傳物質導入載體的關鍵，通過合適的酶切位點，可以將一個或多個外源DNA片段插入到載體[3]。盡管目前多克隆位點標準配置序列的酶切位點足夠豐富，但是實際的研究中會遇到目的基因片段與載體的酶切位點不匹配，致使目的基因片段插入載體相當困難[4]。另外，利用限制性內切酶和連接酶構建質粒載體時需要對DNA進行切割并回收目的片段，然后再用連接酶將其連接，這些操作使得傳統的酶切連接克隆技術在應對大規模、高通量構建需求時具有一定的局限性[5]。

為了克服用酶切連接技術構建表達載體所遇到的問題，Invitrogen公司根據λ 噬菌體基因組和大腸桿菌基因組之間的位點專一性重組分子機制開發了一套分子克隆新技術，即Gateway克隆技術[6]。Gateway克隆技術是一種通用性的克隆方法，利用該技術可以快速、高效地將目的基因同時構建到多種與 Gateway 技術兼容的載體系統，用于功能分析和蛋白質表達[7-9]。它基于lambda噬菌體的位點特異性重組反應（attB×attP→attL×attR），在目的片段兩端添加attB重組位點，將含attB重組位點PCR產物與含attP重組位點的入門載體混合，在BP酶的催化下發生反應，把目的基因克隆到入門載體上，同時在入門載體上形成新的attL位點。含新的attL位點的入門載體在LR重組酶的催化下和含attR位點的表達載體發生反應，從而達到將目的基因克隆到功能載體的目的[10-11]。與經典克隆多個步驟相比，該方法只需一步生化反應便能達到克隆目的，是高通量克隆基因的好方法。一旦構建獲得包含目的基因的入門載體，這個入門克隆可以與任何Gateway下游目的載體進行LR重組反應，構建多種表達系統，用于基因超量表達、基因沉默、啟動子分析、蛋白質亞細胞定位等研究[12-14]。另外，Gateway技術采用了致死基因ccdB的篩選方法，能確保高效率的分離陽性重組克隆[15]。盡管Gateway技術是高通量克隆基因的好方法，但由于專利等原因，Gateway后續表達系統不如經典的表達載體高效。

本研究以整合Gateway重組技術克隆的高效性和傳統質粒表達的穩定性為目的，把帶重組位點的序列插入到原核表達載體pET-28a和pGEX-4T-1上，構建具有重組位點及ccdB致死基因的原核蛋白表達載體。以胡椒HMGB開放讀碼框序列為目的片段，經兩步重組構建到原核表達載體pET-28a和pGEX-4T-1上，通過體外IPTG誘導，分別獲得帶His和GST標簽的蛋白，驗證了該方法的可行性和正確性，為改造質粒載體提供一個新思路。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

質粒及菌株入門載體pDONR Zeo購自Life Technologies公司;原核表達載體pGEX-4T-1購自Amersham公司;pET-28a購自Novagen公司;菌株TOP10、DB3.1、Rosetta由華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室棉花課題組惠贈。

主要生化試劑：限制性內切酶、T4連接酶、DNA擴增酶購自New England Biolabs（NEB）公司;BP、LR重組酶，Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside（IPTG）、抗生素購自Life Technologies公司;蛋白質電泳相關試劑購自伯樂（Bio-Rad）公司;PCR產物純化、質粒提取試劑盒購自天根公司;其他試劑均為國產分析純產品。

引物：實驗中所設計的引物（表1）全部委托上海英駿生物技術有限公司（Invitrogen）合成。

1.2 ?方法

1.2.1 ?重組ccdB序列克隆 ? 以BglⅡ-attB1序列為上游引物，XhoⅠ-attB2為下游引物，pDONR Zeo質粒為模板進行PCR擴增（95 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環;72 ℃延伸10 min），獲得“BglⅡ-attB1-ccdB-attB2-XhoⅠ”片段，經電泳檢測大小準確后回收;回收產物克隆到pGEM-T載體上，轉化大腸桿菌TOP10，提取陽性克隆質粒，用BglⅡ、XhoⅠ在37 ℃ 、buffer 2體系進行雙酶切反應2 h，回收目的片段待用。

1.2.2 ?原核表達載體改造 ? 用BamHⅠ和XhoⅠ酶切pET-28a、pGEX-4T-1質粒，酶切體系為BamHⅠ、XhoⅠ各1 μL，質粒10 μg，buffer 2 μL，補雙蒸水至20 μL，37 ℃反應2 h，電泳檢測后挖膠回收。將酶切、回收后的載體及“BglⅡ-aatB1-ccdB-attB2-XhoⅠ”重組片段在T4連接酶的作用下16 ℃反應10 h。反應產物熱激轉化大腸桿菌DB3.1感受態，通過博來霉素（100 μg/mL）篩選陽性菌落，經PCR驗證后，抽提質粒，保存菌株（檢測引物見表1）。

1.2.3 ?原核表達載體驗證 ? 根據研究室已構建的胡椒葉片cDNA文庫信息，選擇PnHMGB基因作為驗證基因，該基因編碼一個約18 ku的蛋白質[16]。設計帶attB接頭引物進行擴增， PCR產物通過天根試劑盒回收。用BP重組酶將回收的PnHMGB基因構建到入門載體pDONR Zeo，轉化大腸桿菌TOP10，挑取陽性克隆送公司測序，并抽提對應陽性克隆質粒。陽性質粒分別與改造后的pET-28a及pGEX-4T-1質粒在LR重組酶的作用下將PnHMGB基因構建到表達載體上，轉化大腸桿菌，挑選陽性克隆，并擴繁，提取質粒。

構建好的pET-28a-PnHMGB、pGEX-4T-1- PnHMGB質粒轉化大腸桿菌表達菌株Rosetta（DE3），挑取陽性菌落，接入1 mL含抗生素（100 μg/mL）的LB培養基，37 ℃搖床培養過夜。取100 μL培養物轉接入10 mL含抗生素（100 μg/mL）的LB培養基中，37 ℃震蕩培養，待OD600在0.5～0.7時，取1 mL培養物為對照，其余的加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，16 ℃震蕩培養8 h。取1 mL誘導培養物及未誘導的培養物，離心收集菌體，用100 μL SDS聚丙烯酰胺溶液懸浮，高溫裂解后進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

2 ?結果與分析

2.1 ?重組型ccdB序列克隆

利用PCR擴增獲得重組ccdB序列，結果顯示重組ccdB片段大約1.8 kb，擴增產物與預期大小符合。將目標片段克隆到T載體，將含有目的序列的T載體進行BglⅡ和XhoⅠ雙酶切，酶切產物片段經電泳檢測與克隆片段大小一致（圖1）。結果表明重組型ccdB序列被準確克隆，可用于進一步實驗。

2.2 ?載體改造與驗證

用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pET-28a及pGEX-4T-1質粒。將含BglⅡ和XhoⅠ酶切位點的重組ccdB序列分別插入到pET-28a和pGEX-4T-1，構建2個含重組位點的原核表達載體。轉化大腸桿菌DB3.1，用通用引物pGEX-F、pGEX-R、T7pro、T7ter進行PCR檢測，如圖1所示，改造成功的原核表達載體比改造前大2 kb左右，通用引物擴增產物包含了300 bp左右的載體序列，因此PCR產物比重組ccdB序列稍大。這些結果表明重組ccdB序列已經成功插入到原核表達載體上（圖1）。

2.3 ?胡椒PnHMGB原核表達載體構建及驗證

PCR擴增胡椒PnHMGB序列，測序結果顯示，該基因開放讀碼框共432 bp，編碼一個大小約為18 ku大小的蛋白（圖2）。選擇測序結果正確的克隆，擴增帶重組位點的PnHMGB片段，在重組酶的作用下構建到pDONR Zeo上。抽提pDONR Zeo-PnHMGB質粒，在LR重組酶的作用下將胡椒PnHMGB序列從pDONR Zeo重組到pET-28a及pGEX-4T-1載體上。

抽提重組正確陽性質粒，熱激轉化轉化大腸桿菌表達菌株Rosetta（DE3），體外IPTG誘導PnHMGB表達。SDS-PAGE電泳結果表明：PnHMGB在pET-28a載體誘導出20 ku左右的特異表達蛋白，pGEX-4T-1載體誘導表達出40 ku左右的特異表達蛋白。正常的PnHMGB蛋白大小為18 ku，在pET-28a載體中表達末端帶有6個His標簽，所以大小應該為20 ku，而在pGEX-4T-1載體中表達末端帶有23 ku大小的GST標簽，因此大小應該為42 ku，如圖3中紅色箭頭所示。通過2個載體的表達，確認PnHMGB能在改造后的載體中成功表達，表明本研究采取的重組型載體改造的方法可行。

3 ?討論與結論

在基因功能驗證的研究中，各種不同類型載體的構建是研究的基礎之一。目前應用最為廣泛的是基于酶切和連接反應的DNA 重組技術，如pCAMBIA真核表達系列，pET原核表達系列等。這類載體在表達效率和穩定性上得到研究者的肯定，目前被廣泛應用在基因功能驗證研究中。而在實際的應用中，研究者根據不同需求對這類載體進行一定的改造。潘求真等[17]利用雙酶切將pEGFP-N1質粒上的多克隆位點（MSC）去除，然后補平連接， 獲得增強型綠色熒光蛋白編碼基因的真核表達載體pEGFP-N1-MSC。為獲得無標記基因轉基因植物、保證轉基因生物安全，周紅等[18]以pCAMBIA1300植物轉化載體為骨架，通過AseI單酶切去除潮霉素標記基因，通過酶切片段的自連接反應構建了無標記基因的植物轉基因載體。基于酶切連接的方法，在載體啟動子改造、表達標簽添加等方面被廣泛應用[19-20]，但是，這類載體的構建其中一個重要環節是選擇合適的酶切位點。由于載體的多克隆位點是固定不變的，常常難以滿足研究的具體需求，盡管稀有酶類，同尾酶的發現彌補了一些缺陷，整體構建的效率沒有質的提升[5，21]。

基于位點特異性重組的Gateway 技術得到越來越多研究人員的青睞，該技術的應用使得外源基因的插入不再受酶切位點的限制，通過兩步重組反應就能實現目的基因的插入，大大提高了載體構建效率[6-8，22]。本研究以整合Gateway重組載體的高效構建和傳統載體的高效表達為目的，從研究的角度出發，展示了一種重組型原核表達載體的改造方法。該方法同樣適用其他載體系統的改造，但是，在實際操作時需要注意以下幾點：（1）Gateway系列載體核心重組和ccdB序列中包含了很多酶切位點，通過常規的方法很難將該序列轉移到載體的多克隆位點。通過分析，我們選擇了用BamHⅠ和XhoⅠ酶切載體，而用BglⅡ和XhoⅠ酶切重組序列，BamHⅠ和BglⅡ為同尾酶，酶切之后形成粘性末端可以在T4連接酶的作用下完成連接，從而達到轉移目的。但是一旦連接成功，BamHⅠ和BglⅡ的位點就被破壞，無法通過再次酶切、轉移[23];（2）連接后的載體因為含有ccdB致死基因，導致一般的DH5α、TOP10菌株無法擴繁，需選用特定DB3.1感受態進行擴繁[24]。（3）當載體完成改造后，必須通過目的基因進行表達驗證，主要是因為致死基因ccdB的序列中含有高級結構，所以無法通過測序來確定讀碼框的正確，一旦在克隆過程中序列出現突變，則會影響到后續的表達研究。本研究選取胡椒PnHMGB作為目標基因驗證載體的構建是否準確，是由該基因序列的特點而定。胡椒PnHMGB序列在蛋白翻譯時存在3種讀碼可能，分別會翻譯出18、9、6 ku等3種蛋白，但只有翻譯出18 ku大小的蛋白才能說明載體按照正確的讀碼方式翻譯蛋白，從而證明在改造過程中載體本身并沒有發生突變、移碼的情況。

通過重組序列克隆、轉移到目的蛋白表達驗證這一系列的實驗操作，本文展示了一種重組型原核表達載體的改造方法，該載體的成功構建可以保證目標片段的插入不再受限于酶切位點的選擇，同時引入ccdB致死基因的篩選方式大大提高了選擇的效率。該研究為載體改造提供了新的思路，豐富并拓展了Gateway重組技術的應用。

參考文獻

[1] 張獻龍， 唐克軒. 植物生物技術[M]. 北京： 科學出版社， 2004.

[2] Sambrook J， Russell D W. 分子克隆實驗指南[M]. 黃培堂， 黃恒樑， 周曉巍， 等譯. 北京： 科學出版社， 2002.

[3] Dallas-Yang Q， Jiang G， Sladek F M. Digestion of terminal restriction endonuclease recognition sites on PCR products[J]. Biotechniques， 1998， 24（4）： 582-584.

[4] 牛 ?麟. pTriEx-4neo載體多克隆位點的改造;抗跨膜TNF-α單克隆抗體C1可變區基因測序及嵌合抗體的構建[D]. 武漢： 華中科技大學， 2009.

[5] 林春晶， 韋正乙， 蔡勤安， 等. 幾種植物轉基因表達載體的構建方法[J]. 生物技術， 2008， 18（5）： 84-87.

[6] Hartley J L， Temple G F， Brasch M A. DNA cloning using in vitro site-specific recombination[J]. Genome Research， 2000， 10（11）： 1 788-1 795.

[7] Katzen F. GatewayR recombinational cloning： a biological operating system[J]. Expert Opinion Drug Discovery， 2007， 2（4）： 571-589.

[8] Karimi M， Depicker A， Hilson P. Recombinational cloning with plant gateway vectors[J]. Plant Physiology， 2007， 145（4）： 1 144-1 154.

[9] Joubès J， De Schutter K， Verkest A， et al. Conditional， recombinase-mediated expression of genes in plant cell cultures[J]. The Plant Journal， 2004， 37（6）： 889-896.

[10] Landy A. Dynamic， structural， and regulatory aspects of lambda site-specific recombination[J]. Annual Review of Biochemistry， 1989， 58（1）： 913-941.

[11] Bushman W， Thompson J F， Vargas L， et al. Control of directionality in lambda site specific recombination[J]. Science （New York， NY）， 1985， 230（4 728）： 906.

[12] Cheo D L， Titus S A， Byrd D R N， et al. Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination： functional analysis of multi-segment expression clones[J]. Genome Research， ?2004， 14（10B）： ?2 111-2 120.

[13] Earley K W， Haag J R， Pontes O， et al. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics[J]. The Plant Journal， 2006， 45（4）： 616-629.

[14] Helliwell C， Waterhouse P. Constructs and methods for high-throughput gene silencing in plants[J]. Methods， 2003， 30（4）： 289-295.

[15] Lund B A， Leiros H K S， Bjerga G E K. A high-throughput， restriction-free cloning and screening strategy based on ccdB-gene replacement[J]. Microbial Cell Factories， 2014， 13（1）： 38.

[16] 范 ?睿， 凌 ?鵬， 顧文亮， 等. 海南蒟 cDNA 文庫的構建及評價[J]. 熱帶作物學報， 2013， 34（4）： 636-640.

[17] 潘求真， 徐曙光， 李 ?佳， 等. 綠色熒光蛋白表達載體的改造和表達[J]. 黑龍江畜牧獸醫， 2007（1）： 13-15.

[18] 周 ?紅， 姜良良， 燕 ?飛， 等. 一種無標記基因植物表達載體的改造方法[J]. 浙江農業學報， 2013， 25（4）： 804-807.

[19] 蘇 ?寧， 孫 ?萌， 李軼女， 等. 水稻葉綠體16S啟動子克隆改造、 載體構建及轉化研究[J]. 植物學報， 2003， 20（3）： 295-301.

[20] 李敬濤， 孫新華， 余 ?剛， 等. 幾種基于pCAMBIA系列多用途新型植物表達載體的改建及優化[J]. 吉林大學學報： 理學版， ?2014， 52（2）： 371-375.

[21] 李 ?磊， 薛 ?薌， 左示敏， 等. 一種改造載體多克隆位點的新方法[J]. 生物技術， 2013， 23（4）： 40-43.

[22] 肖素勤， 孫 ?振， 軒秀霞， 等. 用于通路（Gateway）克隆技術的植物表達載體研究進展[J]. 植物科學學報， 2012， 30（5）： 528-544.

[23] 姚玲玲， 王家寧， 黃永章， 等. 利用同尾酶技術構建pET15b-PEP-1-CAT重組質粒[J]. 鄖陽醫學院學報， 2006， 25（1）： 1-6.

[24] Parr R D， Ball J M. New donor vector for generation of histidine-tagged fusion proteins using the Gateway Cloning System[J]. Plasmid， 2003， 49（2）： 179-183.