SCoT分子標記技術在木薯遺傳多樣性分析中的應用

周慧文 單建偉 馮斗 嚴華兵

摘 ?要 ?應用SCoT標記對不同來源的28份木薯種質資源進行遺傳多樣性和親緣關系分析。結果表明：從36條引物中篩選出19條重復性好、條帶清晰的引物對28份木薯材料進行PCR擴增。共擴增出171條帶，其中多態性條帶123條，平均每條引物擴增多態性條帶6.5條，多態性條帶比率為71.9%。經NTSYS-pc2.10e軟件計算分析，28份木薯種質間遺傳相似系數在0.631～0.930之間。利用UPGMA法進行聚類的結果顯示：在系數0.68處，木薯材料分為2大類，品種BRA354單獨成為一類;在系數為0.734處，28份木薯種質資源主要聚為5大類，聚類結果與材料來源有一定相關性。SCoT標記能在木薯種質間檢測出一定程度的遺傳多樣性，可為木薯遺傳育種提供新的技術支持。

關鍵詞 ?木薯;SCoT;分子標記;遺傳多樣性

中圖分類號 ?S533 ? ? ? ? ?文獻標識碼 ?A

Application of SCoT Molecular Marker in the

Genetic Diversity Analysis of Cassava

ZHOU Huiwen1，2， SHAN Jianwei1， FENG Dou1， YAN Huabing2 *

1 Guangxi University， Nanning， Guangxi 530004， China

2 Cash Crops Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China

Abstract ?In this paper，SCoT molecular marker technique，which can be used to detect markers associated with functional genes，was applied in the analysis of genetic diversity and relationships among 28 cassava accessions from different geographic locations. The results showed that，a total of 171 loci were detected with 19 primers screened from 36 SCoT primers in the tested accessions. In the 171 bands，123 were polymorphic with the polymorphism of 71.9%; and the average polymorphic number was 6.5 per primer. The genetic similarity coefficient among the accessions were calculated with NTSYS-pc2.10e software， and the value was between 0.631 and 0.930. The results of UPGMA clustering analysis showed that，28 cassava germplasms could be divided into two groups where the coefficient was 0.68; The accession BAR354 alone was clustered into one group，and the rest accessions were clustered into another group. The accessions could be divided into five groups where the coefficient was 0.734. This paper revealed that SCoT molecular marking technique could be used to detect some DNA polymorphism in cassava germplasms，which could provide a technical support for cassava breeding.

Key words ?Cassava; SCoT; Molecular marker; Genetic diversity

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.08.013

木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科木薯屬植物，耐旱抗貧瘠，廣泛種植于非洲、美洲和亞洲等100多個國家或地區[1]。木薯是三大薯類作物之一，熱帶地區第三大糧食作物，全球第六大糧食作物，被譽為“淀粉之王”，是世界近六億人賴以生存的糧食。木薯用途廣泛，可食用、飼用和加工成各種工業產品，如淀粉、酒精等[2]。

作物種質資源評價是作物遺傳改良的重要基礎，只有充分了解種質資源，才能為育種工作提供科學依據。木薯是一種遺傳背景復雜、基因型高度雜合，有性子代嚴重分離的作物，這為木薯品種選育提供了眾多選擇機會。然而由于木薯種質系譜不清，在雜交親本選配時存在很大的盲目性，育種效率低，造成大量人力、物力和財力的浪費。結合植物學性狀調查與分析，利用分子標記技術可為木薯雜交育種親本的選擇提供理論指導。隨著近年來分子標記技術的發展，SSR、RFLP、RAPD等分子標記技術都曾相繼被應用于木薯的遺傳多樣性分析中。早在1993年，Beeching等[3]就利用RFLP對木薯種質資源進行遺傳多樣性分析。在國內，李開綿、王文泉等專家團隊在木薯分子標記技術應用方面做了大量工作，鄒積鑫等[4]利用微衛星標記（SSR）對中國89個木薯品種進行遺傳多樣性分析;韋祖生等[5]利用EST-SSR標記對木薯種質庫進行遺傳多樣性檢測;齊蘭等[6]也曾利用SRAP標記對木薯品種進行分類鑒定。

目標起始密碼子多態性分子標記（start condon targeted polymorphism，SCoT）是Collard和Mackill[7]在水稻上提出的基于SPAR（單引物擴增反應）的新的目的基因分子標記方法，其原理是根據植物基因中的ATG翻譯起始位點側翼序列的保守性，設計單引物并對基因組進行擴增。SCoT標記結合了ISSR標記和RAPD標記的優點，操作簡單，成本低廉，多態性豐富，能有效地產生與性狀聯系的標記，是一種能跟蹤性狀的新的分子標記，有利于分子標記輔助育種[8-9]。已有前人將該技術成功應用于龍眼[10]、柑橘[11]、花生[12]、菊花[13]、蘭花[14]、牡丹[15]和菠蘿[16]等作物的遺傳多樣性分析中。雖然國內外陸續有人對木薯做了分子標記研究，但尚未見SCoT分子標記應用于木薯種質遺傳多樣性分析中的相關研究報道。

本文利用SCoT技術分析28份木薯種質資源的遺傳多樣性，以期通過該實驗，彌補該技術在木薯中應用的空白，并為木薯的親緣關系研究、資源鑒定及分子標記輔助育種等提供新的可操作利用的分子標記技術方法。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗地點與材料

本實驗在廣西大學亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室進行。供試28份木薯種質由廣西農業科學院經濟作物研究所提供（表1）。36條SCoT 引物序列參照Collard和Mackill（2009）文中所列[7]，由上海生工生物工程有限公司合成。DL 15 000 Marker、dNTPs、Taq DNA聚合酶等試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?DNA提取 ? 2014年6月，在廣西農科院建木薯育種基地，從編號材料采集自頂端起第三片展開葉，裝袋編號后放置冰盒，帶回實驗室冰箱保存待提取DNA。DNA的提取參考改良CTAB提取法[17]。將提取好的DNA稀釋成50 ng/μL，放于-20 ℃攝氏度冰箱保存。

1.2.2 ?SCoT-PCR擴增與檢測方法 ? PCR反應在Bio-rad T100 Thermal Cycler PCR儀上進行。采用20 μL PCR擴增體系，其中包含10×PCR buffer（Mg2+）2.0 μL、引物0.6 μL（10 μmol/L）、dNTPs 2 μL（2.5 mmol/L）、Taq DNA聚合酶1.5 U、DNA 2 μL（30 ng/L），其余用滅菌的ddH2O補充。PCR程序設定為：94 ℃預變性4 min;94 ℃變性30 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共35個循環;72 ℃最后延伸5 min。擴增反應結束后，取6 μL擴增產物，經0.8%瓊脂糖凝膠中電泳、GoldView核酸染色劑染色后在紫外凝膠成像系統上拍照保存。使用的電泳儀為Bio-rad廠家生產的PowerPac universal，電泳槽為北京六一廠的DYCP-34A，設定電壓為120 V，運行時間為80 min。

1.2.3 ?數據分析方法 ? SCoT產物按同一遷移水平下的條帶有無分別賦值，有帶記為1，無帶記為0，建立SCoT標記的0、1矩陣。將矩陣輸入NTSYS-pc2.10e軟件中，計算遺傳相似系數，并用不加權成對算術平均法（UPGMA）進行聚類分析。

2 ?結果與分析

2.1 ?SCoT擴增結果分析

從36條SCoT引物中篩選出19條擴增條帶清晰、多態性豐富的引物進行擴增。擴增產物多介于250～2 500 bp之間（圖1）。19條引物共擴增出171條帶，每條引物擴增條帶數在5～16條之間，平均每條引物能擴增出9條帶。每條引物擴增出的多態性條帶數介于4～12條之間，平均每條引物擴增多態性條帶為6.5條，總體多態性條帶比率達71.9%。擴增結果表明利用SCoT 標記進行擴增可檢測到較多的遺傳位點，擴增條帶清晰分明，重復性好，表現出了豐富的多態性（表2）。

2.2 ?相似性分析

用NTSYS-pc2.10e軟件計算19條SCoT引物擴增結果在28份木薯種質之間的相似系數，得到相似性矩陣。華南205與南植199的相似系數最大，為 0.930;其次為NK-1與華南8號的遺傳相似系數，為0.924;新選048與華南10號的相似系數為0.860;相同來源的幾個材料相似系數較高，如NK-6與NK-7、NK-6與NK-3、NK-7與NK-3的相似系數分別為0.819、0.826、0.877，TAI27與TAI2、TAI8與TAI1的相似系數均為0.813;其余相似系數較高的種質有TAI2與COL608的相似系數為0.836;TAI27與桂熱5號的相似系數為0.836;NK-6與新選048的相似系數為0.825;NK-10與新選048的相似系數為0.860。遺傳相似系數最低的是BRA354與CG1141-1，僅為0.631;COL22與BRA949的遺傳相似系數為0.637;TAI27與 BRA354的遺傳相似系數為0.655。

2.3 ?聚類分析

用NTSYS-pc2.10e軟件對19條引物標記的171個遺傳位點進行聚類分析，構建28個木薯品種的聚類樹狀圖（圖2）。從圖2中可知，在相似系數0.68處，可將28份木薯種質分為兩大類。第一類只包含一個材料，即BRA354，其余南植199等27份種質歸為一類。在相似系數0.734的水平，可將第二大類的27份種質分為4個亞組。第I亞組包括南植199、華南205、F520及NK-2 4份種質。第II亞組含華南8號、NK-1、華南10號、新選048、NK-10、桂熱3號、BRA191、NK-3、NLK-7及NK-6 共10份種質。第III亞組包括桂熱5號、TAI27、COL608、TAI2、TAI1、TAI3、CG1141-1、COL22、BRA1109、BRA1148及TAI8 共11份種質。第IV亞組包括BRA949和COL304 共2份種質。

3 ?討論與結論

隨著分子標記技術的發展，植物種質資源遺傳多樣性的評價已不再局限于形態學、細胞學以及生化標記，RAPD、SSR、ISSR、AFLP、SRAP 及新近開發的 SCoT 分子標記技術已廣泛應用于植物遺傳多樣性的分析及評價[18]。RFLP、RAPD、SSR、ISSR及AFLP 4種標記都是傳統意義上的隨機分子標記，而 SRAP、SCoT標記為目的基因分子標記，得到的位點可能是目的基因的一部分或與目的基因緊密聯鎖，更利于分子標記輔助育種[19]。本實驗運用SCoT技術分析了28份不同來源的木薯種質資源的遺傳多樣性，獲得了良好的實驗結果。在實驗中所參照的36條引物也被前人應用于柑橘、菊花、牡丹等植物的SCoT擴增，可見SCoT引物通用性強，可在不同物種中使用。本研究中篩選出的19條引物在28份木薯種質中檢測出了豐富的遺傳多樣性，平均多態比率達71.9%，低于曾霞等[20]利用RAPD技術研究木薯遺傳背景的所得的實驗結果（多態性比率為83.9%），僅次于齊蘭等[6]利用SKAP標記對木薯進行分類鑒定的實驗結果（多態性比率為73.4%），與夏秀忠[21]使用AFLP進行木薯遺傳多態性研究的實驗結果相當（多態性比率為71.7%）。可見，SCoT能檢測出一定程度的多態性，可滿足對木薯進行遺傳多樣性檢測的需要。因此，可利用SCoT技術進行木薯遺傳多樣性檢測及分子標記輔助育種。

從聚類結果可以看出，分組具有一定的地域性，來源于同一國家或同一地區的種質組成一組，但同一組中也包含不同國家地區的材料，如第III亞組含來自中國、泰國、哥倫比亞及巴西的材料。從品種來源看，在中國審定的桂熱5號品種即是從泰國大田作物研究中心引入的木薯品系編號Huay-Bong-60（R5×KU50的雜交后代），而泰國的很多品種也是從哥倫比亞國際熱帶農業研究中心（CIAT）直接引進或從引起材料后代選育而來。因此，由于木薯種質資源引種交流頻繁，不同來源的資源間也存在交叉聚類的現象。來自同一地理位置材料的遺傳相似系數較高，而來自不同地理位置材料的遺傳相似系數普遍偏低，說明木薯的遺傳變化與地理區域的遠近呈現一定的相關性。在本實驗的聚類結果中，BRA354單獨聚到了一類。經查明，該木薯材料通用名是Mandiocaba，疑似為甜木薯品種，與其它栽培種可能存在較大的遺傳差異。在前人的研究中，華南205與南植199兩份材料并未聚在一起。而在本實驗中，它們表現出高度相似的遺傳背景，可能原因在于，由于SCoT標記是與性狀緊密聯系的標記，2份材料在某些性狀上存在較高的相似性而聚在一起。另外，中國的木薯種質間遺傳相似系數較高，大部分達0.750以上，這與曾霞等[20]利用RAPD標記技術對中國44份木薯主要種質遺傳多樣性進行分析的研究結果一致，說明中國木薯品種遺傳背景較為狹窄，遺傳多樣性還不夠豐富，還需進一步增大引種力度，從其他地區引進種質資源，以豐富木薯種質資源多樣性，提高遺傳改良潛力，為中國培育優良品種木薯奠定良好基礎。

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