MEK1/2抑制劑PD98059對ox-LDL誘導HUVEC損傷的保護機制及對LOX-1表達影響*

孫 珊，胡紅玲，段曉宇，吳欽欽，賀映俠，卜曉芬，明小燕，嚴鳳琴，朱 虹

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院綜合二科,武漢 430022)

氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)對內皮細胞、平滑肌細胞等有毒性作用，能夠破壞細胞完整性，損壞內皮細胞的屏障保護功能[1-4]。低密度脂蛋白受體-1(lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1,LOX-1)能夠與ox-LDL特異性結合促進一系列信號通路的激活，誘導內皮細胞發生炎性損傷[5]。干擾LOX-1的表達可以通過激活RhoA/Rho信號來抑制ox-LDL引起的內皮細胞損傷[6]。在人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)中抑制MEK1/2信號通路可以顯著降低脂多糖誘導的細胞損傷[7-8]。本研究應用ox-LDL誘導HUVEC產生損傷，探究PD98059抑制MEK1/2信號通路是否可以通過調節LOX-1的表達以抑制ox-LDL對HUVEC產生的損傷，現報道如下。

1 材料與方法

1.1細胞和試劑 人HUVEC株購自美國典型菌種保藏中心(ATCC)，DMEM高糖培養基及胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自美國Gibco公司，四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)干粉和二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購自美國Sigma公司，MEK抑制劑PD98059購自美國Invivgon公司，MEK1/2抗體購自美國Cell signaling technology公司，LOX-1抗體(ab126538)、RhoA抗體(ab54835)、ROCK1抗體(ab45171)和ROCK2抗體(ab71598)購自英國Abcam公司，RNA提取試劑Trizol裂解液和反轉試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)購自中國大連Takara生物公司，蛋白濃度測定BCA試劑盒購自武漢Bio-swamp公司，RIPA蛋白裂解試劑盒購自中國碧云天生物公司，聚肌苷酸購自中國辰璽生物科技公司；一氧化氮(NO)檢測試劑盒購自碧云天生物公司，ELISA試劑盒購自武漢Bio-swamp公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養和分組 HUVEC培養于含10% FBS的DMEM高糖培養基中，置于5% CO2的37 ℃培養箱中孵育；然后使用0.3%的胰酶消化并進行傳代培養，以對數生長期細胞作為實驗材料分為陰性對照組(普通培養基培養)、ox-LDL組(培養基中加入終濃度為50 μg/mL的ox-LDL)、陽性對照組(培養基中加入終濃度為250 μg/mL的聚肌苷酸及終濃度為50 μg/mL的ox-LDL)和PD98059+ox-LDL組(培養基中加入終濃度為50 μmol/L PD98059和終濃度為50 μg/mL的ox-LDL)，所有細胞均培養72 h。

1.2.2反轉錄PCR檢測LOX-1 mRNA水平 采用Trizol裂解液提取細胞RNA，并測定RNA的質量和濃度。取1 μg RNA使用反轉錄試劑盒進行cDNA合成。LOX-1上游引物：5′-ACT CTC CAT GCT GCT GCC TGG-3′，下游引物：5′-CAT TCA GCT TCC GAA CAA GGG-3′；β-actin上游引物：5′-GAC CAC AGT CCA TGC CAT CAC-3′，下游引物5′-GTC CAC CAC CCT GTT GCT GTA-3′。反轉錄PCR 反應體系為20 μL (2×SYBR Premix Ex TaqTM9 μL,模板1 μL,上游引物和下游引物各0.5 μL,H2O 9 μL)，95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環。

1.2.3MTT法檢測細胞增殖 使用含10% FBS的DMEM培養基將培養24、48和72 h后的HUVEC重懸成單個細胞懸液，將細胞密度調整為1×104個/mL，并將細胞懸液接種于96孔板中，每孔加MTT 溶液(5 mg/mL) 20 μL，于37 ℃，5% CO2培養箱中培養4 h后，離心并去除上清液。每孔加入100 μL DMSO，充分震蕩至使晶體充分溶解；酶標儀檢測波長為490 nm時各組的吸光度(OD)值，并以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.2.4Western blot檢測MEK1/2、RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白水平 使用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗細胞2次并用細胞裂解液裂解。使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。各組取等量蛋白(30 μg)進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳，隨后將表達產物電轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上室溫環境反應2 h；5%脫脂牛奶封閉膜1 h后在4 ℃環境中加一抗孵育過夜；用PBS-Tween洗滌3次，加二抗室溫孵育1 h。以β-actin作為內參，使用BandScan5.0 軟件進行圖像的分析。

1.2.5ELISA檢測細胞培養液中炎性因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6)水平 收集各組細胞培養液，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行檢測培養液中的TNF-α和IL-6水平。

1.2.6硝酸還原法檢測細胞培養液中NO水平 收集細胞培養液，嚴格按照試劑盒說明書進行HUVEC培養液中NO水平的檢測。

2 結 果

2.1各組HUVEC中LOX-1表達的變化 ox-LDL組LOX-1 mRNA表達水平顯著高于陰性對照組(P<0.05)，陽性對照組和PD98059+ox-LDL組LOX-1的mRNA水平與ox-LDL組比較顯著降低(P<0.05)。使用Western blot進行LOX-1的蛋白表達分析，ox-LDL組顯著高于陰性對照組，且PD98059+ox-LDL組的LOX-1蛋白水平顯著低于ox-LDL組(P<0.05)，見圖1。

A：各組LOX-1 mRNA表達情況；B：Western blot結果；C：各組LOX-1蛋白表達情況；a：P<0.05，與陰性對照組比較；b：P<0.05，與ox-LDL組比較

圖1 各組LOX-1表達變化

a：P<0.05，與陰性對照組比較；b：P<0.05，與ox-LDL組比較

2.2各組HUVEC增殖能力變化 與陰性對照組比較，各組增殖能力受到顯著抑制(P<0.05)。與ox-LDL組比較，陽性對照組和PD98059+ox-LDL組增殖能力得到顯著的提高(P<0.05)，見表1。

2.3各組HUVEC中MEK1/2、RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白表達水平 與陰性對照組比較，ox-LDL組MEK1/2、RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；與ox-LDL組比較，陽性對照組和PD98059+ox-LDL組中MEK1/2、RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，見圖2。

a：P<0.05，與陰性對照組比較；b：P<0.05，與ox-LDL組比較

圖2各組信號通路相關蛋白的變化

2.4各組HUVEC中TNF-α和IL-6水平變化 與陰性對照組比較，ox-LDL組TNF-α和IL-6水平顯著升高(P<0.05)；與ox-LDL組比較，陽性對照組和PD98059+ox-LDL組HUVEC中的TNF-α和IL-6水平顯著降低(P<0.05)，見圖3。

a：P<0.05，與陰性對照組比較；b：P<0.05，與ox-LDL組比較

圖3各組TNF-α(A)和IL-6(B)水平變化

2.5各組HUVEC培養液中NO水平變化 與陰性對照組比較，ox-LDL組NO水平顯著下降(P<0.05)；與ox-LDL組比較，陽性對照組和PD98059+ox-LDL組NO水平上升(P<0.05)，見圖4。

a：P<0.05，與陰性對照組比較；b：P<0.05，與ox-LDL組比較

圖4各組NO水平變化

3 討 論

LOX-1是一種在內皮細胞、巨噬細胞和血管平滑肌細胞中大量表達的ox-LDL受體，屬于C型凝集素家族Ⅱ型膜蛋白[9]。LOX-1可以通過與ox-LDL特異性結合誘導內皮細胞分泌和釋放大量細胞黏附分子，促進單核細胞與活化的內皮細胞之間黏附和聚集，這是誘發動脈粥樣硬化的主要因素[10-11]。本研究發現ox-LDL可以誘導HUVEC中MEK1/2和RhoA/ROCK信號通路活化，促進炎性因子的釋放[12-13]。HUANG等[14]研究表明四甲基吡嗪可以通過抑制ox-LDL誘導的MAPK信號通路激活，保護ox-LDL引起的內皮細胞損傷從而達到緩解動脈粥樣硬化的發展。MAPK是細胞內重要的信號傳遞和轉導通路，可以通過信號轉導將細胞外刺激轉移到細胞內，在細胞的生長、分化和增殖中發揮重要調節作用[14]。MEK1/2是MAPK信號通路中的重要家族之一，在細胞應激和炎性反應中具有重要作用[15]。已有多項研究證明PD98059能夠與MEK1/2的非活化形式特異性結合阻止其磷酸化的發生，從而阻斷ERK1/2信號轉導[16-17]。RhoA/Rho激酶信號通路在內皮功能障礙、炎癥、氧化應激、血管張力異常和血管重塑等多種血管疾病中具有重要作用[6]。本研究發現抑制MEK1/2信號通路能夠通過降低LOX-1的表達抑制ox-LDL誘導的MEK1/2和RhoA/ROCK信號通路激活。黃起壬等[8]在探究脂多糖對HUVEC作用的研究中也證實抑制MEK1/2信號通路可以降低脂多糖誘導的HUVEC中ICAM-1的上升，從而抑制脂多糖誘導的HUVEC損傷。

NO具有舒張血管的作用，可以通過抑制平滑肌細胞增殖及血小板的聚集，降低白細胞的黏附作用，具有減輕動脈粥樣硬化的作用[18]。研究表明氨氯地平可以抑制ox-LDL誘導的NO合酶下調，從而促進NO的合成，降低ox-LDL引起的內皮細胞損傷[19]。本研究中抑制MEK1/2信號通路可以通過降低NO和炎性因子的釋放抑制ox-LDL誘導的內皮細胞損傷。姜華等[20]研究中藥對脂多糖誘導HUVEC中炎性因子表達，表明降低HUVEC中的LOX-1和TNF-α可以有效緩解ox-LDL誘導的HUVEC損傷。

綜上所述，本研究通過體外細胞實驗證實PD98059抑制MEK1/2信號通路可以降低ox-LDL特異性受體LOX-1的表達，從而抑制RhoA/ROCK信號通路及降低炎性因子TNF-α和IL-6的釋放，促進HUVEC的增殖及NO的合成，從而抑制ox-LDL誘導的內皮細胞損傷，為臨床治療動脈粥樣硬化提供理論基礎。

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