δ阿片受體激動劑對膿毒癥大鼠肝線粒體呼吸功能的保護作用

唐成武等

[摘要] 目的 探討δ阿片受體激動劑DADLE（D-Ala2-D-Leu5-enkephalin）對膿毒癥大鼠肝線粒體呼吸功能的保護作用。 方法 將60只健康雄性SD大鼠隨機分為膿毒癥組（SEP組，n=20）、假手術組（SO組，n=20）和DADLE組（n=20）。采用改良盲腸結扎穿孔方法建立膿毒癥大鼠模型，假手術組除不結扎刺穿盲腸，DADLE組建立模型后按5 mL/kg劑量腹腔注射濃度為0.5 mg/mL的DALDE。制模8 h后處死大鼠， 取血清檢測ALT和AST水平，取肝組織測定肝細胞線粒體呼吸功能及肝組織ATP、ADP、AMP含量。 結果 DADLE組大鼠呼吸控制率（RCR）、磷/氧化（ADP/O）與SEP組比較顯著升高（P<0.05）， DADLE組肝臟ATP含量明顯高于SEP組（P<0.05）。DADLE組與SEP 組比較血ALT和AST水平明顯降低（P<0.05）。 結論 DADLE對膿毒癥大鼠肝臟線粒體呼吸功能具有保護作用，可改善肝細胞能量代謝。

[關鍵詞] δ阿片受體激動劑；膿毒癥；盲腸結扎穿孔；線粒體

[中圖分類號] R96 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）16-0008-03

[Abstract] Objective To study the protective effect of δ opioid receptor agonist DADLE（D-Ala2-D-Leu5-enkephalin） on mitochondrial respiratory function in a rat model of sepsis. Methods Sixty SD rats were randomly divided in to sham operated group （SO）， septic group （SEP）， and DADLE group （DADLE）， each of 20 cases. Sepsis model was produced by cecal ligation and puncture （CLP）. In SO group，the abdomen was opened without any other treatment. In DADLE group， DADLE （0.5 mg/mL） was administer at a dose of 5 mL/kg by intra-peritoneal injection after CLP. All rats were sacrificed 8 hours after CLP. ALT and AST in blood were determined. Mitochondrial respiratory function was evaluated by the clark oxygen eletrode. The levels of ATP， ADP， AMP were determined by high performance liquid chromatography （HPLC）. Results RCR and ADP/O in DADLE group were much higher than that in SEP group （P<0.05）. ATP in DADLE groups were much higher than SEP group （P<0.05）， while ALT and AST of DADLE group were significantly lower than SEP group （P<0.05）. Conclusion DADLE can protect mitochondrial respiratory function and improve the hepatocellular energy metabolism in sepsis.

[Key words] DADLE； Sepsis； CLP； Mitochondria

在膿毒癥（sepsis）發展過程中肝臟是易受累的重要器官，因為膿毒癥早期便可出現線粒體結構和功能的破壞，而線粒體在肝細胞物質代謝、信息轉導和細胞凋亡等方面起著至關重要的作用，因此肝臟線粒體的損傷常常導致肝細胞能量代謝障礙及內環境紊亂， 最終介導肝細胞死亡[1-3]。膿毒癥早期肝細胞大量壞死，肝功能損害發展為肝功能衰竭往往是膿毒癥引起多器官功能衰竭（MODS）的開始和重要標志[4，5]。2013年6～10月我們以非選擇性阿片受體激動劑DADLE處理膿毒癥大鼠，并觀察其對肝細胞線粒體呼吸功能的保護作用。

1 材料與方法

1.1分組及膿毒大鼠癥模型制備

健康清潔級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（7～8周齡，體重：270～320 g） 60只由斯萊克（SLAC，上海）實驗動物有限責任公司提供，隨機分為膿毒癥組（SEP組，n=20）、假手術組（SO組，n=20）和DADLE組（n=20）。

膿毒癥大鼠模型制備：剖腹后找到盲腸，結扎盲腸遠端，對傳統的盲腸結扎穿孔（CLP） 方法進行改良：結扎盲腸遠端后用12號針頭穿刺近端盲腸造成穿孔，將盲腸穿孔數由2個增至4個[6]，而SO組僅行剖腹但不結扎刺穿盲腸，其余操作同膿毒癥組。DADLE組在膿毒癥模型建立后立即按5 mL/kg的劑量腹腔注射DADLE溶液（濃度：0.5 mg/mL）進行處理。各組制模后給予常規抗休克補液處理，制模后8 h將大鼠以頸椎脫臼法處死，取血及肝臟組織進行相關檢測。

1.2 肝臟線粒體制備

秤取10 g大鼠肝臟組織，迅速置于0℃分離液（含EDTA 1 mmol/L，蔗糖0.25 mol/L、Tris-HCl 5 mmol/L，pH7.4）， 間斷超聲勻漿3 min，將制備好的組織勻漿以2×103 r/min離心8 min，留取上清液，以1×104 r/min離心15 min，棄去上清液，以分離液將沉淀重懸浮，再次以1×104 r/min離心15 min，再次棄去上清液，最后以2 mL分離液吹打重懸浮所得沉淀，即線粒體懸液。所得線粒體懸液內蛋白濃度以雙縮脲法測定，再用分離液調整到合適濃度備用。

1.3 大鼠肝臟線粒體呼吸耗氧功能的測定

RCR=ADP啟動（加入ADP 時）的態3呼吸速率/線粒體琥珀酸啟動（ADP 耗竭后）的態4呼吸速率。態3呼吸速率和態4呼吸速率采用Clark氧電極技術測定。反應體系總體積3 mL，pH 7.35～7.45，包含：KCl 0.01 mol/L、MgCl2 5 mmol/L、琥珀酸0.2 mol/L、Tris-HCl 0.01 mol/L、蔗糖0.25 mmol/L、KH2PO4 5 mmol/L、ADP 加入濃度為0.33 mmol/L，線粒體蛋白濃度為1 g/L，計算呼吸控制率（respiratory control ratio，RCR）、磷/氧化（ADP/O）。

1.4 血清AST、ALT測定

采用美國貝克曼奧林巴斯AU680全自動生化分析儀檢測大鼠血清AST、ALT水平，所需試劑由該公司提供。

1.5 大鼠肝臟組織AMP、ADP、ATP含量測定

稱取30 mg大鼠肝臟組織放入0.5 mL冷卻的10% HClO4中，在冰浴下間斷超聲勻漿3 min，并迅速制成20% 的勻漿液。將制備的肝臟組織勻漿液在4℃下以8×103 r/min離心min，留取上清液，置4℃ 冰箱保存待檢。

高效液相色譜儀（HPLC）系統購自美國Waters 公司，包括： 486型高效液相色譜儀，510型自動進樣泵和Millenium數據處理軟件系統。色譜條件預柱為Nova-pak C18（3.9×150 mm，3.5 μm），流動相為NH4H2PO4緩沖液（濃度為0.1 mol/L，pH值為5.3），流速為0.9 mL/min，進樣量為20 μL，紫外線檢測波長為254 nm，靈敏度為0.01 AUFS，柱溫為室溫。

將AMP、ADP及ATP標準品（購自美國Sigma公司）分別配制成濃度梯度為0.0100 mmol/L、0.0200 mmol/L、0.0625 mmol/L和0.1250 mmol/L的標準液，取20 μL標準液進樣，計算并繪制出標準曲線。將檢測樣品獲得的AMP、ADP及ATP峰面積與標準品峰面積相比，計算大鼠肝臟組織ATP、ADP及AMP的含量[μmol/（g·wet）]。

1.6 統計學處理

采用SPSS 17.0統計學軟件處理。計量資料用（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肝臟組織AMP、ADP、ATP含量和血清ALT、AST水平的變化

與SO組比較，SEP組和DADLE組ATP含量均明顯降低（P<0.05），而DADLE組肝臟ATP含量較SEP組明顯升高（P<0.05）。與SO組比較，SEP組和DADLE組血清ALT和AST 水平均明顯升高（P<0.05），而DADLE組則明顯低于SEP組（P<0.05），見表1。

2.2 各組大鼠肝臟線粒體呼吸功能的變化

與SO組比較，SEP組、DADLE組的RCR和ADP/O均明顯降低（P<0.05），而態3呼吸速率和態4呼吸速率明顯升高（P<0.05）；而DADLE組與SEP組比較，RCR和ADP/O明顯提高（P<0.05），態3呼吸速率和態4呼吸速率明顯降低（P<0.05），提示膿毒癥時肝線粒體呼吸速率明顯受到抑制，DADLE處理后顯著改善了線粒體的呼吸速率，見表2。

3 討論

雖然當前針對膿毒癥的研究已取得了很大進展[7]，但其發展過程中多器官功能障礙綜合征（MODS）的機制仍不明確。膿毒癥的一個主要特征是細胞病理性缺氧及氧利用障礙，導致線粒體氧化磷酸化障礙、能量產生下降[8]。膿毒癥時由于炎癥因子大量釋放、氧自由基水平升高和鈣超載導致早期即可出現肝臟氧供需失衡、肝細胞能量代謝和內環境紊亂[9-11]，而導致急性肝損害甚至肝功能衰竭。本實驗中我們發現，CLP制模后8 h血清ALT、AST水平明顯升高，表明肝臟在膿毒癥早期就已經受到累及，且反應劇烈，炎癥造成大量肝細胞死亡，從而導致不同程度的肝損傷。本研究中我們發現經過DADLE處理，DADLE組大鼠血清ALT和AST水平明顯低于膿毒癥組，說明DADLE能明顯減輕膿毒癥對大鼠肝臟的損害，改善肝功能。

線粒體是一個細胞器，它是細胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，最基本的功能是通過氧化磷酸化過程將ADP、AMP轉換為ATP，而且線粒體在細胞內信號轉導和細胞凋亡等方面也起著至關重要的作用。線粒體損傷一般都表現為線粒體形態腫脹、內、外膜完整性破壞、嵴紊亂，形態學定量分析發現嵴的膜表面密度和膜間空隙明顯增加，基質密度降低。另外，線粒體內膜和外膜受損機制不盡相同，內膜受損可能與線粒體MPTP開放有關，而外膜受損可能與線粒體通透轉換無關，初步證據顯示Bax可能參與外膜損害[12]。因此在嚴重創傷、感染等病理情況下，一旦線粒體膜結構和功能受到破壞[13]，可引起細胞能量代謝和細胞內環境紊亂，甚至引起細胞死亡，因此以線粒體為靶向的治療逐漸受到關注。

RCR 與ADP/O比值一起，是用來衡量線粒體結構功能完整與否及氧化磷酸化偶聯程度的靈敏指標。RCR值為ADP啟動的態3呼吸速率與琥珀酸啟動的態4呼吸速率的比值； ADP/O值是指線粒體每吸收一克原子氧的同時，生成ATP 的克分子數的比值，它反映線粒體的能量轉化效率。ADP/O降低代表氧化磷酸化能量生成脫耦連，合成ATP 的能力下降。本研究通過檢測RCR（呼吸控制率）和ADP/O來反映線粒體的呼吸功能及合成ATP的能力。本研究發現，膿毒癥時肝臟ATP含量下降，RCR和ADP/O均明顯降低，提示線粒體功能受損，肝臟能量代謝紊亂。DADLE是一種非選擇性δ阿片受體激動劑，我們以往的研究已經證明其能明顯改善膿毒癥大鼠的存活率[14，15]，在本研究中DADLE處理組肝ATP含量較SEP組明顯升高，同時RCR和ADP/O也有明顯提高，這表明DADLE對膿毒癥大鼠肝臟線粒體呼吸功能具有保護作用，從而改善了肝細胞在膿毒癥缺氧狀態下的能量代謝。

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（收稿日期：2015-01-22）